Esta investigación fue fundada por la Sociedad Alemana de Investigación (BO5534). Agradecemos a Antonia Kiwitt, Moritz Lenz, Johanna Hagens, la Dra. Annika Heuer y el PD Dr. Ingo Königs por proporcionarnos muestras. Además, los autores agradecen al equipo de la Instalación de Imágenes de Microscopía de la UKE (Instalación central, Facultad de Medicina de la UKE) por su apoyo con la microscopía de inmunofluorescencia.

Este estudio incluyó tejidos de ratón derivados de experimentos aprobados por la Administración Estatal de Investigación Animal de Hamburgo, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburgo, Alemania (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). Los tejidos utilizados fueron pulmón y colon de ratón de un modelo séptico y piel quemada. Se utilizaron ratones machos y hembras de 8 semanas de edad. En todos los experimentos se siguió la Directiva Europea 2010/63/UE relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos. Las muestras humanas anonimizadas incluyeron tejidos de enterocolitis neonatal, piel quemada, atresia biliar, espondilodiscitis y miocardio. Según el Comité de Ética de la Investigación Médica de Hamburgo, las muestras no necesitaron consentimiento informado, pero el estudio fue aprobado por el comité (WF-026/21).
1. Fijación de la muestra
<ol><li>Utilice el siguiente protocolo derivado de Abu Abed y Brinkmann para la fijación de muestras, la deshidratación, la inclusión en parafina, el seccionamiento y el montaje 3,15.<ol><li>Prepare una solución de formaldehído al 4% disolviendo 40 g de paraformaldehído (PFA) en 800 ml de solución salina tamponada con Tris, pH 7,4 (TBS).</li>
		<li>Agitar la mezcla a 60 °C bajo una campana extractora hasta que el PFA se haya disuelto. Lleve la solución a temperatura ambiente (RT) y ajuste el volumen con TBS a 1.000 ml.</li>
		<li>Ajusta el pH a 7,4. Conservar a 4 °C durante 2-3 semanas o a -20 °C durante un máximo de 1 año.</li>
	</ol></li>
	<li>Para la fijación de la muestra, coloque el tejido fresco en tampón TBS y diseccione en trozos de menos de 20 mm x 30 mm x 3 mm. Sumerja las secciones de tejido en una solución de paraformaldehído al 4% durante 12-24 h. NOTA: El protocolo original utilizaba una solución de PFA al 2% y un tiempo de fijación de 8-20 h. Con este método, algunas secciones de tejido no se fijaron completamente después de 20 h, por lo que la concentración de PFA se incrementó al 4% de PFA.</li>
	<li>Transfiera las muestras a casetes de procesamiento de tejidos etiquetados. Use marcadores o lápices resistentes a solventes para etiquetar.</li>
	<li>Inicie la deshidratación de la muestra sumergiendo los casetes en etanol al 70% durante 1 h. Luego, sumérjalo en etanol al 80%, etanol al 90%, etanol al 96% y dos veces en etanol al 100%, con una duración de 1 h en cada paso.</li>
	<li>Sumergir dos veces en xileno al 100% (dimetilbenceno) y luego dos veces en parafina a 60 °C durante 1 h cada vez.</li>
	<li>Use moldes de inclusión para el montaje y deje que la parafina se solidifique antes de quitar el molde.</li>
	<li>Utilice un micrótomo para cortar secciones de tejido de 3 μm de grosor.</li>
	<li>Utilice unas pinzas para colocar las secciones cortadas en un baño de agua a 37 °C y déjelas flotar en la superficie para estirar los cortes de tejido.</li>
	<li>Coloque las secciones en portaobjetos de vidrio adhesivo (Tabla de materiales) y déjelas secar durante la noche en una cámara de calor a 40 ° C.</li>
</ol>2. Rehidratación de la muestra
<ol><li>Para la desparafinación, apile los portaobjetos en una rejilla de portaobjetos y sumérjalos dos veces durante 5 minutos cada uno en el medio de reemplazo de xileno limoneno (Tabla de materiales) y una vez durante 5 minutos en una mezcla 1:1 de limoneno / etanol. PRECAUCIÓN: El limoneno es inflamable a 50 °C y puede causar reacciones alérgicas. Úselo debajo de una campana extractora con protección para los ojos y guantes. Manténgase alejado del fuego abierto.</li>
	<li>Rehidrate las muestras en una serie descendente de etanol sumergiendo la rejilla de portaobjetos dos veces en etanol al 100 % y una vez en etanol al 96 %, al 90 % de etanol, al 80 % de etanol y al 70 % de etanol durante 5 minutos cada una.</li>
	<li>Sumerja la rejilla de portaobjetos durante 5 minutos en agua desionizada (agua desionizada) para limpiar cualquier resto de etanol.</li>
</ol>3. Bloqueo de autofluorescencia y recuperación de antígenos
<ol><li>Prepare la solución de recuperación de citrato de pH 6 (TRS) (Tabla de materiales) de acuerdo con la hoja de datos. Este TRS se concentra 10 veces. Por lo tanto, diluya 1:10 con agua desionizada. Precalentar en un tarro de plástico a 96 °C. NOTA: TRS rompe los puentes de metileno formados durante la fijación de la muestra para exponer los epítopos del antígeno. Esto permite que los anticuerpos primarios se unan a su antígeno diana. Almacenar TRS concentrado a 2-8 °C durante 8 meses. Siempre prepare TRS fresco.</li>
	<li>Saque los portaobjetos de la rejilla de portaobjetos y colóquelos en una cámara húmeda. Pipetear una o dos gotas de agente reductor de autofluorescencia (Tabla de materiales) en cada muestra. Incubar durante 5 min. NOTA: El agente reductor de autofluorescencia bloquea la autofluorescencia tisular inherente causada por fluoróforos y fijadores endógenos. Almacene el agente reductor de autofluorescencia en RT hasta por 1 año. NOTA: Trabaje solo con pequeñas secciones de tejidos para evitar que las muestras se sequen o excedan el tiempo de incubación.</li>
	<li>Vuelva a apilar los portaobjetos en la rejilla de portaobjetos y enjuague durante 1 minuto con etanol al 60 % con un movimiento hacia arriba y hacia abajo hasta que se haya eliminado todo el reactivo reductor de autofluorescencia no utilizado.</li>
	<li>Sumerja la rejilla deslizante durante 5 minutos en agua desionizada.</li>
	<li>Para la recuperación de antígenos, transfiera los portaobjetos a un frasco de tinción con el TRS precalentado. Incubar durante 10 min a 96 °C en un baño maría. NOTA: El baño de agua a 96 °C se puede sustituir por un microondas o una cocina de vapor si el TRS se precalienta a 96 °C y se garantizan 10 minutos de tiempo de incubación a 96 °C.</li>
	<li>Saque el frasco de tinción y déjelo enfriar lentamente a RT durante aproximadamente 60-90 minutos. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí hasta por 4 h, dejando las diapositivas en el TRS.</li>
	<li>Retire el TRS, pero mantenga los portaobjetos en el frasco. Enjuague dos veces con solución salina tamponada con Tris con 0.05% de Tween (TBST, pH 7.4) durante 3 minutos cada una para eliminar cualquier residuo de TRS sobrante.</li>
	<li>Para la permeabilización, prepare Triton al 0,2 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, y llénelo en el frasco de tinción para permeabilizar las muestras durante 10 min. NOTA: La permeabilización mejora la unión de los anticuerpos primarios con las proteínas diana intracelulares en las muestras fijas.</li>
	<li>Enjuague los portaobjetos nuevamente dos veces en TBST durante 3 minutos cada vez.</li>
	<li>Prepare la cámara húmeda y coloque los portaobjetos. Limpie el exceso de agua de los portaobjetos con pañuelos de papel. Encierre cada muestra en un círculo con una pluma de barrera hidrofóbica para evitar que la solución de anticuerpos se escurra. NOTA: No deje que las muestras se sequen. Lo mejor es trabajar con secciones pequeñas.</li>
</ol>4. Bloqueo de la unión de anticuerpos inespecíficos
<ol><li>Tome una solución de bloqueo lista para usar con suero de burro (Tabla de materiales) y pipetee una gota en cada muestra. Incubar durante 30 min en RT. NOTA: Este paso de bloqueo minimiza la unión del anticuerpo secundario a sitios de unión no específicos en la muestra. Después de bloquear estos epítopos inespecíficos y aplicar el anticuerpo primario, el anticuerpo secundario se unirá al anticuerpo primario y no interactuará con la superficie del tejido. Este reactivo de bloqueo listo para usar se almacena a 2-8 °C durante 6 meses.</li>
	<li>Retire el exceso de solución de bloqueo de los portaobjetos golpeando el borde de los portaobjetos contra una superficie dura. No los enjuague.</li>
</ol>5. Anticuerpo primario
<ol><li>Diluir los anticuerpos primarios en el tampón de dilución de anticuerpos (Tabla de materiales). Utilice aproximadamente 100 μL de la solución final para cada muestra. Para el anticuerpo NE y H3cit (R8) y el isocontrol, diluir a una concentración de 5 μg/mL. Para MPO y el isocontrol correspondiente, utilice 10 μg/mL. Prepare un tubo para cada anticuerpo primario y uno para cada anticuerpo de isocontrol. NOTA: H3cit (R8)/MPO o NE/MPO y sus isocontroles pueden combinarse para la tinción de NETs. Para la combinación de H3cit (R8)/MPO, diluir hasta una concentración final de 5 μg/ml para H3cit (R8) y 10 μg/ml para MPO hasta un volumen final de 100 μl por muestra. Para NE/MPO, diluir a una concentración final de 5 μg/mL para NE y 10 μg/mL para MPO a un volumen final de 100 μL por muestra. Para el isocontrol, utilice la misma concentración que para cada anticuerpo correspondiente. Utilice siempre una nueva punta de pipeta para cada anticuerpo utilizado. Los anticuerpos primarios pueden almacenarse a 4 °C durante 1-2 semanas y a -20 °C o -80 °C durante un máximo de 1 año.</li>
	<li>Con dos muestras en un portaobjetos, utilice una para los anticuerpos de isocontrol y otra para la dilución de anticuerpos MPO/H3cit o MPO/NE. Utilice aproximadamente 100 μL para cada muestra y distribuya la solución de anticuerpos de manera uniforme. NOTA: No deje que las muestras se sequen. Tenga cuidado de no mezclar el isocontrol y los anticuerpos primarios.</li>
	<li>Conservar en una cámara húmeda durante la noche a 4 °C.</li>
	<li>Al día siguiente, retira el exceso de solución de anticuerpos primarios de los portaobjetos y apila los portaobjetos en una cubeta. Enjuague tres veces durante 5 minutos cada vez con TBST para eliminar la solución de anticuerpos primarios restante.</li>
</ol>6. Anticuerpo secundario
<ol><li>Prepare la solución de anticuerpos secundarios. Utilice dos anticuerpos secundarios fluorescentes diferentes: burro-anti-cabra para MPO y burro-anti-conejo para la tinción de H3cit. Diluir cada uno a una concentración de 7,5 μg/mL con tampón de dilución de anticuerpos (Tabla de materiales). NOTA: Para la tinción doble, utilice dos anticuerpos fluorescentes con diferentes áreas de excitación y una superposición espectral mínima. Combinar ambos anticuerpos secundarios y diluir hasta una concentración final de 7,5 μg/ml para cada anticuerpo para obtener un volumen final de 100 μl por muestra. Protege los anticuerpos de la luz. Los anticuerpos secundarios pueden almacenarse a 2-8 °C durante 6-8 semanas o a -80 °C durante un máximo de 1 año.</li>
	<li>Mantenga los portaobjetos en la cámara húmeda y agregue 100 μL de la solución de anticuerpos secundarios a cada muestra. Déjalos incubar durante 30 min a RT y protegidos de la luz.</li>
	<li>Retire el exceso de solución de anticuerpos secundarios y apile los portaobjetos en la rejilla de portaobjetos. Sumergir tres veces durante 5 minutos cada una en un frasco de tinción lleno de PBS para eliminar los anticuerpos restantes no unidos.</li>
	<li>Prepare la solución de DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) (Tabla de materiales) y diluya a una concentración de 1 μg/ml con agua desionizada. Sumerja la rejilla de portaobjetos en un frasco de tinción con solución DAPI e incube durante 5 minutos a RT en la oscuridad. NOTA: DAPI se utiliza como tinción fluorescente para ADN bicatenario. La solución DAPI preparada se puede utilizar varias veces. Guarde la solución DAPI preparada en RT. El concentrado DAPI puede almacenarse a -20 °C durante un máximo de 1 año.</li>
	<li>Sumerja la rejilla de portaobjetos durante 5 minutos en un frasco de tinción con PBS para lavar el exceso de solución DAPI.</li>
</ol>7. Montaje y almacenamiento de las muestras, análisis microscópico
<ol><li>Monte las muestras con cubreobjetos y medio de montaje (Tabla de materiales). NOTA: Utilice solo pequeñas cantidades de medio de montaje y limpie el exceso de medio con pañuelos húmedos. Use guantes y evite limpiar accidentalmente cualquier medio de los cubreobjetos o portaobjetos. Evite la formación de burbujas y use hisopos de algodón para presionar suavemente los cubreobjetos para eliminar las burbujas de los portaobjetos.</li>
	<li>Para obtener imágenes, utilice un microscopio de campo amplio o un microscopio confocal. NOTA: Tome primero una imagen del isocontrol. Reduzca el tiempo de exposición de los filtros de fluorescencia (excepto el filtro azul para DAPI) hasta que casi no se pueda detectar ninguna señal. A continuación, utilice esta configuración para examinar las muestras correspondientes. Busque áreas donde se pueda detectar una señal fluorescente en cada muestra individual utilizando el canal de fluorescencia. Después de tomar una imagen del área, el programa genera una imagen compuesta de todos los canales y muestra las diferentes señales de fluorescencia como una superposición de diferentes colores. A continuación, la imagen se puede analizar más a fondo para su colocalización con software de imágenes como ImageJ.</li>
	<li>Guarde los portaobjetos a 4 °C durante un máximo de 6 meses.</li>
</ol>

Tinción e imágenes para visualizar trampas extracelulares de neutrófilos

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin,+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans.">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).</li><li>Abu Abed, U., Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+labelling+of+human+and+murine+neutrophil+extracellular+traps+in+paraffin-embedded+tissue.">Immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. 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Neutrophil extracellular traps license macrophages for cytokine production in atherosclerosis.</a> Science. 349 (6245), 316-320 (2015).</li><li>Schauer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregated+neutrophil+extracellular+traps+limit+inflammation+by+degrading+cytokines+and+chemokines.">Aggregated neutrophil extracellular traps limit inflammation by degrading cytokines and chemokines.</a> Nature Medicine. 20 (5), 511-517 (2014).</li><li>Radermecker, C., Hego, A., Delvenne, P., Marichal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantitation+of+neutrophil+extracellular+traps+in+human+tissue+sections.">Identification and quantitation of neutrophil extracellular traps in human tissue sections.</a> BioProtocol. 11 (18), e4159 (2021).</li><li>de Buhr, N., von K&#246;ckritz-Blickwede, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+neutrophil+extracellular+traps+become+visible.">How neutrophil extracellular traps become visible.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).</li><li>Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+NETs+in+paraffin-embedded+tissue.">Immunodetection of NETs in paraffin-embedded tissue.</a> Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).</li><li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage,+infiltrate+tissues,+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus.">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).</li><li>Santos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETs+detection+and+quantification+in+paraffin+embedded+samples+using+confocal+microscopy.">NETs detection and quantification in paraffin embedded samples using confocal microscopy.</a> Micron. 114, 1-7 (2018).</li><li>Savchenko, A. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+neutrophil+extracellular+traps+in+paraffin-embedded+feline+arterial+thrombi+using+immunofluorescence+microscopy.">Identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), e60834 (2020).</li><li>Stehr, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+drive+epithelial-mesenchymal+transition+of+human+colon+cancer.">Neutrophil extracellular traps drive epithelial-mesenchymal transition of human colon cancer.</a> Journal of Pathology. 256 (4), 455-467 (2022).</li><li>Th&#229;lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histones:+Development+of+an+improved+assay+to+reliably+quantify+nucleosomal+H3Cit+in+human+plasma.">Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).</li><li>Yamashita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-induced+antigen+retrieval:+Mechanisms+and+application+to+histochemistry.">Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+cell+membranes.">Permeabilization of cell membranes.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li><li>Smyth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-vascular+interactions+drive+myeloperoxidase+accumulation+in+the+brain+in+Alzheimer's+disease.">Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38 (2022).</li><li>Whittington, N. C., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+red+blood+cell+autofluorescence+for+immunocytochemistry+on+fixed+embryonic+mouse+tissue.">Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).</li><li>Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+autofluorescence+quenching+techniques+on+formalin-fixed+chicken+tissues.">Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues.</a> Journal of Immunological Methods. 496, 113097 (2021).</li><li>Schneider, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IVIG+regulates+the+survival+of+human+but+not+mouse+neutrophils.">IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1296 (2017).</li><li>Risso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+antimicrobial+peptides:+Multifunctional+effector+molecules+of+innate+immunity.">Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity.</a> Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este trabajo, nuestro objetivo era adaptar y optimizar los protocolos existentes para la obtención de imágenes de TNE a más tipos de tejidos, comenzando con el proceso de tinción real. El primer paso crítico para este método es la selección de los anticuerpos más adecuados. Para la NE, probamos un anticuerpo de NE de un huésped de ratón en tejido humano, que no mostró una tinción confiable en comparación con la NE de un huésped de conejo. Además, Thålin et al. propusieron H3cit (R8) como un anticuerpo ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65272">Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues</a>. The Authors section was updated from:
Lavinia Sch&#246;enfeld1 
Birgit Appl1 
Laia Pagerols-Raluy1 
Annika Heuer3 
Konrad Reinshagen1 
Michael Boettcher1,2 
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg 
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg 
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)
to:
Lavinia Schoenfeld1 
Birgit Appl1 
Laia Pagerols-Raluy1 
Annika Heuer3 
Konrad Reinshagen1 
Michael Boettcher1,2 
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg 
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg 
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65272">Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Las trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) fueron visualizadas por primera vez por Brinkmann et al. como una vía de muerte celular diferente de la apoptosis y la necrosis en 20041. En esta vía, los neutrófilos liberan su cromatina descondensada en el espacio extracelular para formar grandes estructuras en forma de red cubiertas de proteínas antimicrobianas que antes se almacenaban en los gránulos o en el citosol. Estas proteínas antimicrobianas incluyen la elastasa de neutrófilos (NE), la mieloperoxidasa (MPO) y la histona citrulinada H3 (H3cit), que se utilizan comúnmente para la detección indirecta por inmunofluorescencia de los TNE2. Este método no solo identifica la presencia cuantitativa de estas proteínas; de hecho, tiene la ventaja de detectar específicamente estructuras similares a NET. En los NETs, las proteínas mencionadas se colocalizan con el ADN extracelular, que puede ser detectado por una superposición de las señales de fluorescencia de cada proteína teñida y el ADN extracelular. A diferencia de las señales superpuestas debidas a la colocalización extracelular de ADN y proteínas en los TNE, los neutrófilos intactos no muestran colocalización. Aquí, los componentes del NET generalmente se almacenan por separado en los gránulos, los núcleos y el citosol3.
Desde su primer descubrimiento, se ha demostrado que los TNE desempeñan un papel central en numerosas enfermedades, especialmente en las que implican inflamación. Los TNE muestran funciones antimicrobianas durante la infección al atrapar y matar patógenos extracelulares en sangre y tejidos 4,5. Sin embargo, los TNE también se han relacionado con enfermedades autoinmunes y respuestas hiperinflamatorias, como el lupus eritematoso sistémico, la artritis reumática y el asma alérgica 6,7,8. Los TNE promueven la vaso-oclusión y la inflamación en la aterosclerosis, la adhesión plaquetaria y se especula que desempeñan un papel en el cáncer metastásico 9,10,11. Sin embargo, se cree que tienen propiedades antiinflamatorias al reducir los niveles de citoquinas proinflamatorias12. Si bien los NET están ganando más interés en un campo de investigación más amplio, un método robusto de detección de NET es fundamental para futuras investigaciones.
A pesar de que la visualización de los TNE en diferentes tejidos mediante imágenes de inmunofluorescencia es compleja y requiere personalización, además de la microscopía electrónica, actualmente es uno de los métodos más reconocidos para visualizar las interacciones entre los TNE y las células y se utiliza predominantemente en tejidos fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE)13,14. Sin embargo, la comparación de las imágenes NET es difícil, ya que los diferentes laboratorios utilizan sus propios protocolos personalizados. Estos protocolos difieren en el uso de anticuerpos, la recuperación de antígenos o el método de permeabilización y, a menudo, están optimizados para un tipo específico de tejido 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ,27.
Después de que Brinkmann et al. publicaran el primer estudio metódico utilizando la visualización inmunofluorescente de NETs en tejido FFPE, quisimos optimizar este protocolo para una variedad más amplia de tejidos y especies15. Además, para establecer un protocolo de inmunofluorescencia ampliamente aplicable, probamos diferentes protocolos modificados de estudios que utilizaron métodos de inmunofluorescencia en tejido FFPE para detectar NETs 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Además, probamos un nuevo anticuerpo H3cit para una tinción extracelular más específica28. Nuestra hipótesis es que mediante la adaptación sistemática de los protocolos de tinción actuales a diferentes especies y tejidos, se pueden mejorar las imágenes in vitro, lo que resulta en una mejor representación de la interacción entre los neutrófilos y los NET tanto a nivel local como sistémico.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neutrophil Elastase antibody 100&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 68672&#160;</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody&#160; 100&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 5103</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 &#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 25989</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 &#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 90810</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovision Microscopy Software&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4.8.2.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>&#160;GTX30972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0101202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI 25 mg</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6335.1</td>
			<td>1:25000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCS antibody dilution 500 mL</td>
			<td>DCS diagnostics</td>
			<td>DCS AL120R500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey ant goat Cy3</td>
			<td>JacksonImmunoResearch</td>
			<td>705-165-147</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit AF647</td>
			<td>JacksonImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit Cy3</td>
			<td>JacksonImmunoResearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide rack</td>
			<td>Roth</td>
			<td>H552.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Mouse MPO Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF 3667&#160;</td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>MKP-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 37415</td>
			<td>1:2000 and 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml</td>
			<td>Maxvision</td>
			<td>MB-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioCamHR3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Bosch</td>
			<td>HMT84M421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 negative control</td>
			<td>Dako</td>
			<td>X0931 Aglient</td>
			<td>1:50 and 1:5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat IgG Control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AB-108-C&#160;</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Phosphate buffered saline (10x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMP staining jar</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2292.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 219406</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 172730</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROTI Histol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>&#160;6640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus slides</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td>03-0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS Tris buffered saline (x10)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>830476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath rice cooker</td>
			<td>reishunger</td>
			<td>RCP-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet chamber</td>
			<td>Weckert Labortechnik</td>
			<td>600016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Widefield microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence imaging of neutrophil extracellular traps in human and mouse tissues

Las trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) son liberadas por los neutrófilos como respuesta a una infección bacteriana o daño tisular traumático, pero también desempeñan un papel en las enfermedades autoinmunes y la inflamación estéril. Son estructuras en forma de red compuestas por filamentos de ADN bicatenarios, histonas y proteínas antimicrobianas. Una vez liberados, los TNE pueden atrapar y matar patógenos extracelulares en la sangre y los tejidos. Además, los TNE participan en la regulación homeostática estimulando la adhesión plaquetaria y la coagulación. Sin embargo, la producción desregulada de TNE también se ha asociado con diversas enfermedades, como la sepsis o los trastornos autoinmunes, lo que los convierte en una diana prometedora para la intervención terapéutica. Aparte de la microscopía electrónica, la visualización de los NET mediante imágenes de inmunofluorescencia es actualmente uno de los únicos métodos conocidos para demostrar las interacciones de los NET en los tejidos. Por lo tanto, se han utilizado varios métodos de tinción para visualizar los NET. En la literatura, se describen diferentes protocolos de tinción, e identificamos cuatro componentes clave que muestran una alta variabilidad entre los protocolos: (1) los tipos de anticuerpos utilizados, (2) el uso de agentes reductores de autofluorescencia, (3) los métodos de recuperación de antígenos y (4) la permeabilización. Por lo tanto, los protocolos de tinción de inmunofluorescencia in vitro se adaptaron y mejoraron sistémicamente en este trabajo para hacerlos aplicables a diferentes especies (ratón, humano) y tejidos (piel, intestino, pulmón, hígado, corazón, disco espinal). Después de la fijación y la inclusión en parafina, se montaron secciones de 3 μm de espesor en portaobjetos. Estas muestras se tiñeron con anticuerpos primarios para mieloperoxidasa (MPO), histona citrulinada H3 (H3cit) y elastasa de neutrófilos (NE) de acuerdo con un protocolo de tinción modificado. Los portaobjetos se tiñeron con anticuerpos secundarios y se examinaron con un microscopio de fluorescencia de campo amplio. Los resultados se analizaron de acuerdo con una hoja de evaluación y las diferencias se registraron de forma semicuantitativa.
Aquí, presentamos un protocolo de tinción NET optimizado adecuado para diferentes tejidos. Utilizamos un nuevo anticuerpo primario para teñir H3cit y redujimos la tinción inespecífica con un agente reductor de autofluorescencia. Además, demostramos que la tinción con NET requiere una temperatura alta constante y un manejo cuidadoso de las muestras.

Neutrophil extracellular traps (NETs) were first visualized by Brinkmann et al. as a pathway of cellular death different from apoptosis and necrosis in 20041. In this pathway, neutrophils release their decondensed chromatin into the extracellular space to form large web-like structures covered in antimicrobial proteins that were formerly stored in the granules or cytosol. These antimicrobial proteins include neutrophil elastase (NE), myeloperoxidase (MPO), and citrullinated histone H3 (H3cit), which are commonly used for indirect immunofluorescence detection of NETs2. This method not only identifies the quantitative presence of these proteins; indeed, it has the advantage of specifically detecting NET-like structures. In the NETs, the mentioned proteins co-localize with extracellular DNA, which can be detected by an overlap of the fluorescence signals of each stained protein and the extracellular DNA. In contrast to the overlapping signals due to extracellular DNA and protein co-localization in NETs, intact neutrophils show no co-localization. Here, the NET components are usually stored separately in the granules, nuclei, and cytosol3.
Since their first discovery, it has been shown that NETs play a central role in numerous diseases, particularly those involving inflammation. NETs show antimicrobial functions during infection through trapping and killing extracellular pathogens in blood and tissue4,5. However, NETs have also been connected to autoimmune diseases and hyperinflammatory responses, like systemic lupus erythematosus, rheumatic arthritis, and allergic asthma6,7,8. NETs promote vaso-occlusion and inflammation in atherosclerosis, platelet adhesion, and are speculated to play a role in metastatic cancer9,10,11. Nevertheless, they are thought to have anti-inflammatory properties by reducing proinflammatory cytokine levels12. While NETs are gaining more interest in a broader field of research, a robust NET detection method is fundamental for future research.
Even though the visualization of NETs in different tissue using immunofluorescence imaging is complex and requires customization, apart from electron microscopy, it is currently one of the most renowned methods for visualizing the interactions between NETs and cells and is predominantly used in formalin-fixed paraffin-embedded tissues (FFPE)13,14. However, comparing NET imaging is difficult, as different laboratories use their own customized protocols. These protocols differ in their use of antibodies, antigen retrieval, or permeabilization method and are often optimized for a specific type of tissue3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27.
After Brinkmann et al. published the first methodic study using immunofluorescent visualization of NETs in FFPE tissue, we wanted to optimize this protocol for a wider variety of tissues and species15. Additionally, to establish a broadly applicable immunofluorescence protocol, we tested different modified protocols from studies that used immunofluorescence methods in FFPE tissue to detect NETs3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Furthermore, we tried a new H3cit antibody for more specific extracellular staining28. We hypothesize that by systematically adapting current staining protocols to different species and tissue, in vitro imaging can be improved, resulting in a better representation of the interaction between neutrophils and NETs both locally and systemically.

Autor destacado: Imágenes de trampas extracelulares de neutrófilos en tejidos humanos y de ratón 

Imágenes de inmunofluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos en tejidos humanos y de ratón

Among antibody selection for tissue imaging, the fixation process poses a challenge by epitope masking. Therefore, customized retriever step is required to expose these antigens for antibody binding. Additionally, tissue inherent autofluorescence can cause difficulties through to a high background staining.However, the use of different approaches in the protocols in the literature hinders a standardized comparison between the images. Our study aims to address the demand for standardized procedures and assist the researcher in overcoming challenges during the imaging process. We established a versatile imaging protocol applicable to different tissues by comparing various different protocols.So our work provides guiding and troubleshooting tips from antibody usage to sample mounting, highlighting the potential pitfalls. Our findings advance research by introducing a new primary antibody for citrullinated hisone three, and an autofluorescent reducing agent to minimize background staining. Furthermore, for successful imaging, we emphasize the careful handling of samples and the importance of maintaining a constant high temperature for antigen retrieval.

Antes de comenzar la optimización de nuestro protocolo, identificamos los pasos clave para una tinción exitosa mediante la búsqueda en PubMed de estudios que utilizaran tejido FFPE para la inmunotinción de TNE y comparamos sus protocolos. Las diferencias de protocolo más prometedoras se identificaron como los pasos clave para la optimización del protocolo, mientras que los pasos que en su mayoría se correspondían entre sí no se modificaron (Tabla 1).
Tabla 1: ...

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Las trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) se asocian con diversas enfermedades, y la inmunofluorescencia se utiliza a menudo para su visualización. Sin embargo, existen varios protocolos de tinción y, en muchos casos, solo se examina un tipo de tejido. Aquí, establecemos un protocolo de aplicación general para la tinción de NET en tejido de ratón y humano.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...

Entre la selección de anticuerpos para la obtención de imágenes de tejidos, el proceso de fijación plantea un desafío mediante el enmascaramiento de epítopos. Por lo tanto, se requiere un paso de recuperación personalizado para exponer estos antígenos para la unión de anticuerpos. Además, la autofluorescencia inherente al tejido puede causar dificultades hasta una alta tinción de fondo.Sin embargo, el uso de diferentes enfoques en los protocolos en la literatura dificulta una comparación estandarizada entre las imágenes. Nuestro estudio tiene como objetivo abordar la demanda de procedimientos estandarizados y ayudar al investigador a superar los desafíos durante el proceso de obtención de imágenes. Establecimos un protocolo de imagen versátil aplicable a diferentes tejidos mediante la comparación de varios protocolos diferentes.Por lo tanto, nuestro trabajo proporciona consejos de orientación y solución de problemas, desde el uso de anticuerpos hasta el montaje de muestras, destacando los posibles escollos. Nuestros hallazgos avanzan en la investigación mediante la introducción de un nuevo anticuerpo primario para la hisona tres citrulinada y un agente reductor autofluorescente para minimizar la tinción de fondo. Además, para obtener imágenes exitosas, enfatizamos el manejo cuidadoso de las muestras y la importancia de mantener una temperatura alta constante para la recuperación de antígenos.

immunofluorescence-imaging-neutrophil-extracellular-traps-human-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

4.1K vistas.  University of Hamburg. Entre la selección de anticuerpos para la obtención de imágenes de tejidos, el proceso de fijación plantea un desafío mediante el enmascaramiento de epítopos. Por lo tanto, se requiere un paso de recuperación personalizado para exponer estos antígenos para la unión de anticuerpos. Además, la autofluorescencia inherente al tejido puede causar dificultades hasta una alta tinción de fondo.Sin embargo, el uso de diferentes enfoques en los protocolos en la literatura dificulta un...

Video: Autor destacado: Imágenes de trampas extracelulares de neutrófilos en tejidos humanos y de ratón 

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in autoimmune diseases and sterile inflammation. They are web-like structures composed of double-stranded DNA filaments, histones, and antimicrobial proteins. Once released, NETs can trap and kill extracellular pathogens in blood and tissue. Furthermore, NETs participate in homeostatic regulation by stimulating platelet adhesion and coagulation. However, the dysregulated production of NETs has also been associated with various diseases, including sepsis or autoimmune disorders, which makes them a promising target for therapeutic intervention. Apart from electron microscopy, visualizing NETs using immunofluorescence imaging is currently one of the only known methods to demonstrate NET interactions in tissue. Therefore, various staining methods to visualize NETs have been utilized. In the literature, different staining protocols are described, and we identified four key components showing high variability between protocols: (1) the types of antibodies used, (2) the usage of autofluorescence-reducing agents, (3) antigen retrieval methods, and (4) permeabilization. Therefore, in vitro immunofluorescence staining protocols were systemically adapted and improved in this work to make them applicable for different species (mouse, human) and tissues (skin, intestine, lung, liver, heart, spinal disc). After fixation and paraffin-embedding, 3 &#181;m thick sections were mounted onto slides. These samples were stained with primary antibodies for myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit), and neutrophil elastase (NE) according to a modified staining protocol. The slides were stained with secondary antibodies and examined using a widefield fluorescence microscope. The results were analyzed according to an evaluation sheet, and differences were recorded semi-quantitatively.
Here, we present an optimized NET staining protocol suitable for different tissues. We used a novel primary antibody to stain for H3cit and reduced non-specific staining with an autofluorescence-reducing agent. Furthermore, we demonstrated that NET staining requires a constant high temperature and careful handling of samples.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are associated with various diseases, and immunofluorescence is often used for their visualization. However, there are various staining protocols, and, in many cases, only one type of tissue is examined. Here, we establish a generally applicable protocol for staining NETs in mouse and human tissue.

Investigación

Inmunología e Infección

﻿Autofluorescence Blocking and Antigen Retrieval in Tissue Samples

Autofluorescence Blocking and Antigen Retrieval in Tissue Samples  

To begin, prepare 10 times concentrated citrate, target retrieval solution or TRS of pH six, according to the manufacturer's instructions. Dilute it to a ratio of 1:10 with deionized water. Then heat the solution in a plastic staining jar to 96 degrees Celsius.Remove the slides from the slide rack and place them into a wet chamber. Next, pipette one or two drops of the autofluorescence-reducing agent onto each tissue sample and incubate the samples for five minutes. Stack the slides back into the slide rack, and rinse for one minute in 60%ethanol using upward and downward motions to remove the unused autofluorescence-reducing reagent.Submerge the slide rack in deionized water for five minutes. Transfer the slides into a staining jar with preheated TRS Buffer for Antigen Retrieval. Incubate the slides for 10 minutes at 96 degrees Celsius in a water bath.Remove the staining jar and let it cool to room temperature for approximately 60 to 90 minutes. Next, remove the TRS while keeping the slides in the jar. Rinse the slides twice with TRIS Buffered Saline containing 0.05%Tween at pH 7.4 for three minutes each to remove any remaining TRS residues.Place the slides in a wet chamber. Gently wipe excess water from the slides using paper tissues, then encircle each sample using a hydrophobic barrier pen to prevent the antibody solution from running off.

Bloqueo de autofluorescencia y recuperación de antígenos en muestras de tejido

Immunofluorescence Staining of Neutrophil Extracellular Traps in Tissue Samples

Begin by pipetting one drop of ready-to-use blocking solution with donkey serum onto the tissue samples. Then incubate the samples for 30 minutes at room temperature. Remove the excess blocking solution from the slides by tapping the edge against a hard surface.Dilute the primary antibodies in the antibody dilution buffer to prepare 100 microliters of the final solution for each sample. Set up the antibodies, one tube for each primary antibody and one for each isocontrol antibody. Evenly spread 100 microliters of isocontrol antibodies to one sample, and 100 microliters of myeloperoxidase and citrullinated histone H3, or myeloperoxidase and neutrophil elastase antibody dilution to the other sample.Place the slides in a wet chamber and store them overnight at four degrees Celsius. The following day, tap off excess primary antibody solution from the slides and stack them in a cuvette. Rinse the slides three times for five minutes each using Tris buffered saline with tween To remove the remaining primary antibody solution.Prepare two distinctly fluorescent secondary antibodies, donkey anti-goat for myeloperoxidase and donkey anti-rabbit for citrullinated histone H3 staining. Dilute each antibody to 7.5 micrograms per milliliter concentration in the antibody dilution buffer. Place the slides in a wet chamber and dispense 100 microliters of the secondary antibody solution onto each sample.Incubate them for 30 minutes at room temperature protected from light. Remove excess secondary antibody solution by tapping the slides. Put the slides in a slide rack.Submerge the slides three times for five minutes each in a staining jar filled with PBS to wash off unbound antibodies. Prepare the dappy solution and dilute it to a concentration of one microgram per milliliter with deionized water. Submerge the slide rack in a staining jar containing the dappy solution and incubate for five minutes at room temperature in the dark.Next, submerge the slide rack in a staining jar with PBS for five minutes to wash off any excess dappy solution. Finally, mount the samples using cover slips and mounting medium. The citrullinated histone H3 antibody only bound to the extracellular histones and showed no staining of intracellular histones.The human or mouse specific myeloperoxidase antibody showed no specific staining. While the universal human and mouse antibodies showed consistent good staining for myeloperoxidase. When no blocking agent was used, some mouse samples showed more non-specific and partial positive staining.When blocked, the five minutes blocking time showed good results compared to the 10 minutes blocking time. The higher temperatures in the microwave and water bath showed consistently moderate to good antigen retrieval. Whereas in a 60 degrees Celsius water bath there was only partially positive to no staining.For double staining, more favorable results were obtained for the samples incubated at 96 degrees Celsius water bath. However, exceeding the incubation time of 40 minutes at 96 degrees Celsius resulted in less intense antibody staining.