Este protocolo describe una técnica para estudiar el evento de calcio evocado mecánicamente en una preparación urotelial ex vivo. La técnica es relativamente fácil de ejecutar y podría adaptarse para estudiar el evento de calcio evocado mecánicamente en otras preparaciones de tejidos nativos. Fabrica las micropipetas colocando el vidrio capilar en el extractor y ajustándolo con las perillas de retención capilar.
Tire del capilar de vidrio en dos pasos según las instrucciones del fabricante. Cierre la punta de las micropipetas con una microforja con la perilla de ajuste del calentador ajustada a 60. Después de exponer la vejiga y el hueso pélvico del ratón sacrificado, rompa el hueso pélvico para exponer la uretra y canular la uretra con un catéter de calibre 24.
Use una sutura 6-0 para asegurar el catéter a la uretra. Recolecte la vejiga y la uretra y fíjelas en una almohadilla de soporte de goma de silicona bañada en la solución de grabación. Separe la mucosa de la vejiga de la capa muscular subyacente con fórceps finos.
Corte la mucosa de la vejiga y fíjela con el urotelio hacia arriba a un inserto de elastómero de silicona en el fondo de una placa de cultivo de tejido de 35 milímetros de diámetro. Monte la placa de cultivo de tejidos con la mucosa de la vejiga fijada en la etapa de microscopio equipada con una incubadora de placa de cultivo con elementos calefactores resistivos. Perfundir la placa de cultivo celular continuamente a una velocidad de 1,7 mililitros por minuto con una solución de grabación calentada a 37 grados centígrados con un calentador en línea.
Mantenga la temperatura de la incubadora de platos de tejido y las soluciones a aproximadamente 37 grados centígrados con un controlador de temperatura bipolar de doble canal. Para registrar transitorios de iones de calcio inducidos mecánicamente, sumerja la micropipeta en la solución de registro. Bajo iluminación de campo claro, utilizando un objetivo de escaneo de bajo aumento, mueva la micropipeta al centro del campo.
Mueva el micromanipulador en el plano vertical y ajuste el enfoque para mover la pipeta cerca de la superficie del tejido urotelial. Cambie al objetivo con un aumento más alto y una apertura numérica adecuada para la inmunofluorescencia. Ajuste el micromanipulador a filas y mueva la pipeta cerca de la parte superior de la celda objetivo.
Si es necesario, ajuste el enfoque y la posición de la pipeta. Abra el protocolo de estimulación en el software de electrofisiología y configúrelo para que se reproduzca. Ajuste el foco y pulse inicio en el gestor de experimentos para iniciar la adquisición de datos.
Esto impulsa el actuador piezoeléctrico y genera un archivo con las imágenes del experimento. Cuando se estimula la célula, se observa un aumento de la fluorescencia. Para cuantificar la intensidad fluorescente, abra el archivo de imagen en el software de imágenes y seleccione la ventana de recuento y medida.
Reproduce la película para identificar la célula estimulada. Seleccione la herramienta polígono y dibuje un ROI en los límites de la celda que se pinchó. Vaya a la ventana de medición, seleccione perfil de intensidad, establezca la medición en horas extras, los resultados en promedio, la resta de fondo en ninguno y, a continuación, presione ejecutar.
La intensidad media de fluorescencia se calculará con el tiempo. Para exportar los datos del perfil de intensidad, haga clic en el icono de Excel en la ventana de resultados del perfil de intensidad y realice el análisis de datos utilizando un software de gráficos científicos y análisis de datos. En este estudio, la célula paraguas fue empujada para evaluar los transitorios de calcio evocados mecánicamente.
La imagen capturada a los 10 segundos muestra una vista fluorescente de la pipeta estimulante colocada en la parte superior de una célula paraguas que expresa un sensor de calcio fluorescente GCaMP5G. La estimulación mecánica de la célula paraguas que expresa el sensor de calcio causa una deformación seguida de un rápido aumento de la emisión de fluorescencia. El gráfico demuestra un cambio en la intensidad de fluorescencia trazada en función del tiempo para varias células.
Pinchar evoca una respuesta de calcio en la mayoría de las células paraguas transducidas con un sensor de calcio fluorescente. El paso más importante es recolectar la vejiga y la uretra, seguido de fijarlos a una almohadilla de soporte de goma de silicona. Evite el daño tisular al separar la mucosa de la vejiga de la capa muscular subyacente.
Los métodos de imagen como el descrito aquí pueden proporcionar una visión única de cómo los canales activados por mecanos envían cambios en su entorno nativo y generan respuestas fisiológicas.
