Los autores agradecen a M. Ficha del Hospital Universitario de Lausana para proporcionar la fotografía mamoplastia, M. Wirth y A. Ayyanan del Instituto Suizo de Investigación Experimental del Cáncer, Centro Nacional de Competencia en Investigación de Oncología Molecular, Facultad de Ciencias de la Vida, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausana para la asistencia técnica y R. Clarke, de la Universidad de Manchester para comentarios críticos. La investigación que lleva a estos resultados ha recibido el apoyo de SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531.817, y la Iniciativa sobre Medicamentos Innovadores empresa común en virtud del acuerdo de subvención no. 115.188, los recursos de los cuales se compone de contribución financiera del Séptimo Programa Marco de la Unión Europea (FP7 / 2007-2013) y la Federación Europea de Industrias y Asociaciones Farmacéuticas empresas »de la aportación no dineraria. La dirección Web de la Iniciativa sobre Medicamentos Innovadores es <a href="http://www.imi.europa.eu/" target="_blank">http://www.imi.europa.eu/</a> . &lt;/ P&gt;

Consideraciones generales: Antes de tiempo, establecer un protocolo de ética, preparar cuestionarios para los pacientes, y ver a la capacitación del personal clínico. Antes de utilizar el material de cirugía mamoplastia de reducción, adquirir las autorizaciones, y asegurar el consentimiento del paciente. El tejido puede ser contagiosa y debe ser manejada en consecuencia. Este protocolo fue aprobado por el comité ético de ISREC - Instituto Suizo de Investigación Experimental del Cáncer. 1. Recuperación de tejidos, producción y Bio-banking Para garantizar la calidad de la muestra óptima para bio-banking, una serie de medidas se llevan a cabo en el hospital antes de su transporte al laboratorio. En el hospital: <ol><li> Obtener los tejidos mamarios humanos en condiciones estériles de cirugía mamoplastia de reducción y muestras de sangre, si es necesario. El tejido debe ser examinado por el patólogo que probar para excluir la presencia de lesiones malignas. </li><li> Coloque la t de mamaemitir bajo el capó en un tablero estéril y preparar tijeras, bisturí quirúrgico y pinzas que ya se esterilizan con esterilizador de vapor. Hacer corte profundo en diferentes sitios del tejido mamario usando un bisturí para abrirlo. En el tejido mamario humano buscar hebras blancas que constan de conductos y los lobulillos, que están incrustados en el tejido adiposo de color amarillo. NOTA: La relación de la parénquima blanco en el tejido adiposo amarillo difiere entre las mujeres; normalmente mujeres más jóvenes tienen más tejido epitelial. </li><li> Elige piezas de material blanco y los mantienen con pinzas, luego separarlos suavemente desde el tejido adiposo con unas tijeras. Evite tomar los vasos sanguíneos. </li><li> Enjuague las piezas de tejido en solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,2 para eliminar la sangre. Transferir el tejido para botellas de plástico 250 ml que contenían medio F12 (F12 medio modificado de Eagle de Dulbecco) sin rojo fenol con 2% de penicilina / estreptomicina (incluyendo 5.000 unidades / ml de penicilina y 5.000 g / ml de estreptomicina) y 1% de unaantibiótica / anfotericina B (incluyendo 10.000 unidades / ml de penicilina, 10.000 g / ml de estreptomicina y 25 mg / ml de anfotericina B). Tejidos de las tiendas en el medio de transporte al laboratorio. </li><li> Preparar piezas de 3 - 5 mm de diámetro para la extracción de ARN y proteínas y flash congelarlos en crioviales de frío (hielo seco) isopentano. Ellos Traslado a la caja de hielo seco para el transporte al laboratorio. </li><li> Ponga trozos de 3-5 mm en el molde y se cubre con una capa de la temperatura óptima de corte (OCT) y luego colocar el molde en la parte inferior plana de caja llena de isopentano frío. Después de congelación completa transferir el molde a la caja de hielo seco. </li><li> Fijar 5 piezas de 3-5 mm de diámetro en paraformaldehído (PFA) 4% y otras 5 piezas en formaldehído (FA) 4% en PBS a análisis histológico RT adelante. Dos fijadores diferentes se recomiendan como algunos anticuerpos funcionan mejor con uno u otro de los dos. </li></ol> En el laboratorio: <ol start="8"><li> Hacercumento toda la información sobre la mamoplastia de reducción, la fecha de la cirugía y si las muestras proceden de la izquierda contra la mama derecha. </li><li> Colocar las muestras congeladas a -80 ° C y transferir los tejidos fijados en casetes de histología después de 2 hr de la fijación. Entonces los puso bien en PBS o 70% de etanol, para O / N de almacenamiento a 4 ° C. Al día siguiente, la transferencia de los cassettes de histología a las instalaciones de histología para la inclusión en parafina. </li></ol> 2. Tejido digestión y la hormona de estimulación <ol><li> Transferencia de las botellas que contienen las muestras de tejido para una cabina de flujo laminar en una habitación de cultivo celular P2. Coloque las piezas de tejido en tajadera estéril (29 x 19 cm). Sujete el material con fórceps y raspar la grasa restante y los vasos de distancia del parénquima mamario (parte blanca) con bisturí. Coloque el material blanco en PBS en una placa de cultivo de 10 cm. </li><li> Después de retirar el material graso de todas las piezas y disponer de ellos de acuerdo con la norma de seguridads del laboratorio, coloque las partes blancas que contienen los tejidos epiteliales de nuevo en la tabla de cortar. Uso de escalpelos opuestas cortar el tejido y cortar en pedazos de hasta 2 mm de diámetro. </li><li> Coloque el material picado en tubos de tamaño adecuado: hasta 1, 2,5 y 10 ml en un 5, 15 o 50 ml tubos, respectivamente. Normalmente un 5 ml rendimientos tubo de material suficiente para empotramiento de parafina y de la hormona estimulaciones, y unos 15 ml produce tubo de material suficiente para la fluorescencia de células activadas (FACS). Tubos más grandes se utilizan para congelar alícuotas. </li><li> Preparar mezcla maestra digestión consiste en medio (DMEM / F12 sin rojo fenol) con 1% de penicilina / estreptomicina / anfotericina B y la colagenasa A (clostridiopeptidasa A partir de Clostridium histolyticum). Dosis colagenasa de acuerdo a los tiempos de digestión. <ol><li> Para 12, 24, y 36 horas de incubación, utilice concentración final de colagenasa de 1,5 mg / ml, 1,0 mg / ml y 0,5 mg / ml respectivamente. Añadir mezcla maestra digestión hasta 4 veces de lavolumen del material digerido para asegurar la agitación y aireación adecuada. NOTA: En función del diseño experimental y la duración de la estimulación hormonal, añadir hormonas ya sea durante o después de la recuperación de paso de digestión enzimática y microestructura. </li></ol></li><li> Añadir la hormona (s) a una concentración deseada para probar las muestras y el vehículo con el control. Para la estimulación con 17-β-estradiol, y promegestona (R5020) utilizar una concentración final de 20 nM. NOTA: R5020 es un agonista del receptor de progesterona sintética, que es más estable que la progesterona natural en el medio. <ol><li> Colocar los tubos en el mezclador de rodillos dentro de una incubadora a 37 ° C y 40 rpm O / N. Antes de colocar las muestras en el mezclador, resuspender ellos muy bien para asegurar que todo el material se distribuye a lo largo de los tubos de centrífuga. </li></ol></li><li> Como la digestión tarda al menos 12 horas (O / N), para tiempos de estimulación de la hormona de menos de 12 horas, añadir las hormonas después de la recuperación de las microestructuras (decola en el paso 3). Añadir las hormonas a medida que volver a suspender las microestructuras y colocar la suspensión en placas ultra-bajas de fijación. Microestructuras de tejido se pueden mantener en placas de fijación ultra-bajas para un máximo de 7 días en medio del factor de crecimiento libre de conservantes alrededor del 70% de viabilidad. </li><li> Para el ARN y el análisis de proteínas, recoger microestructuras de tejido por centrifugación a 400 xg durante 5 min y flash congelación en tubos de centrífuga. </li></ol> 3. Recuperación de microestructuras de tejido <ol><li> Centrifugar el tubo (s) a 400 xg durante 5 min. Aspirar la grasa de la parte superior del tubo de centrífuga y transferir el sobrenadante del sobrenadante acuosa restante, que está enriquecido en los fibroblastos, a un nuevo tubo de centrífuga y se centrifuga a 1250 xg durante 5 min. NOTA: Como las microestructuras de tejido de mama son muy pegajosas, para todos los pasos subsiguientes resuspender el sedimento suavemente agitando el tubo. Pipeteo no se recomienda debido al riesgo de perder material. </li&gt; <li> Resuspender los pellets enriquecidos en microestructuras y en los fibroblastos derivados de sobrenadante acuoso en PBS, 2% de suero de ternera fetal (FCS). Posteriormente girar ambos tubos a 1.250 xg durante 5 min y luego desechar los sobrenadantes. </li><li> Resuspender los pellets en 3-5 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos de la sangre y transferirlas a tubos limpios. Incubar durante 5 min a TA. </li><li> Añadir 2x volumen de PBS, 2% de FCS y se centrifuga ellos en 1250 xg durante 5 min. Lavar los pellets con PBS, 2% de FCS y se centrifuga a 1250 xg durante 5 min. Repita este paso dos veces. </li></ol> 4. Las muestras de citometría de flujo <ol><li> Añadir 1 - 2 ml de tripsina al 0,25% al ​​sedimento y se mezcla pipeteando arriba y abajo muy suavemente durante 2 min con un Pipetman 1000 l para disociar las células. </li><li> Inhibir la actividad de la tripsina mediante la adición de 9 ml de PBS, 2% FCS. Centrifugar a 450 xg durante 5 min y resuspender el pellet en 10 ml de PBS, 2% FCS. </li><li> Transferir la suspensión de células en un filtro de células de 40 micras colocado en top de un tubo de centrífuga de 50 ml para preparar células individuales. Si unos pocos microlitros de suspensión de células se mantienen en la parte superior del filtro, ayudarles a pasar a través del filtro mediante la aspiración de ellos desde el otro lado del filtro con una pipeta y añadirlos a las microestructuras filtrados. </li><li> Anticuerpos células inmunes separadas, fibroblastos y células endoteliales de microestructuras con un cóctel de anticuerpos anti-CD45, anti-FAP y anti-CD31 y luego a ordenar con FACS, basado en EpCAM marcador pan-epitelial y CD10 para separar las células luminales y basales respectivamente 10 . </li></ol> 5. Las muestras para histología <ol><li> Después de lavar el material digerido mecánica y enzimáticamente como se describe anteriormente, fijar gránulos de 1,5 ml de material inicial en 1 ml de PFA al 4% en PBS a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Centrifugar a 1250 xg durante 5 min y se lava con 1 - 2 ml de PBS dos veces. </li><li> Centrifugar a 16000 xg durante 10 min. Durante este tiempo, preparar 1% de usos múltiples de agarosa en Tris-acetato-EDTA (TAE) tampón y calentar la solución en el horno microondas hasta que la solución hierva. <ol><li> Retire la solución del horno de microondas y agitar el frasco suavemente para mezclar la solución y volver a suspender las partículas de agarosa restantes. Solución de agarosa Enfriar a 50 ° C y se vierte 1 ml en un molde base de parafina de tamaño 31 × 23 × 13,5 mm. </li></ol></li><li> Descartar el sobrenadante y colocar las pastillas en la parte superior de la capa solidificada (1 - 3 mm) de agarosa usando una espátula con un extremo plano. Cubra todo con una capa adicional de agarosa (40 ° C). </li><li> Después de que se solidifique agarosa, generalmente dentro de 5 minutos, poner los bloques de agarosa en los cassettes de histología para empotramiento en parafina. Junto con las muestras de agarosa colocan un papel blanco de oficina en el cassette con toda la información sobre el número de mamoplastia de reducción, la condición experimental, y la fecha escrita en letras pequeñas en lápiz; este escrito soporta todas las etapas de tratamiento posteriores. </li><li> Ponga los casetes enPBS O / N, o en el 70% de etanol para el almacenamiento durante el fin de semana, a 4 ° C. No hemos notado ninguna diferencia entre las dos soluciones de almacenamiento. A continuación, traslado a las instalaciones de cassettes de histología histología para la inclusión en parafina. </li></ol> 6. Las microestructuras de congelación (Futuro cultivo) <ol><li> Microestructuras de tejido resuspender en medio de congelación que consiste en FCS con 10% de sulfóxido de dimetilo (DMSO) y congelar alícuotas de 1 ml en crioviales. El número de crioviales obtenidos depende de la cantidad de material primario obtenido a partir de mamoplastia de reducción. </li><li> Congelar los crioviales que contienen microestructuras de tejido usando un congelador de velocidad controlada con el siguiente programa: 5 min vivienda a 4 ° C, disminuyendo la temperatura a -7 ° C con una tasa de 6 ° C / min, la disminución de la temperatura a -12 ° C con tasa de 6 ° C / min, 10 min vivienda, disminuyendo la temperatura a -40 ° C con una tasa de 6 ° C / min, la disminución de la temperatura a -80 ° C contasa de 6 ° C / min. A continuación, traslado los crioviales a -80 ° C congelador. </li><li> Al día siguiente, transferir los crioviales de -80 ° C a tanque de nitrógeno líquido para almacenamiento a largo. </li></ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

El cultivo ex vivo descrito aquí proporciona microestructuras de tejido de mama que contienen conductos y lóbulos intactos, junto con otros tipos de células que se encuentran normalmente en el pecho femenino humano. En el procesamiento del tejido de mama humano generalmente obtenido a partir de mammoplasties de reducción, la eliminación de tejido adiposo, la digestión mecánica y enzimática de la matriz estromal, y la lisis de las células rojas de la sangre enriquece para los fragmentos conducto de lech...

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Marie Shamseddin
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Marie Shamsheddin

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Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Información sobre el paisaje mutacional en el cáncer de mama está aumentando a ritmo rápido. Se ha prestado menos atención a los factores sistémicos que influyen en el desarrollo del cáncer de mama. La exposición a las hormonas reproductivas tiene un impacto importante en la progresión de la enfermedad 1-3. Sin embargo, los mecanismos por los cuales las hormonas reproductivas inciden en el pecho humano, son poco conocidos. Trabajar con modelos de ratones genéticamente modificados ha revelado que implican células de señalización intrínseca y paracrina través de varios efectores 4. El conocimiento limitado acerca de la acción de la hormona en el pecho humano es atribuible en gran medida a la falta de modelos adecuados. La mayoría del trabajo sobre los mecanismos de receptor de estrógeno (ER) y receptor de progesterona de señalización (PR) se ha realizado con receptores hormonales positivos líneas celulares de cáncer de mama, tales como MCF-7 y T47D. Estos se derivan de los derrames pleurales de pacientes con cáncer de mama avanzado que tenía already recibió múltiples tratamientos 5. La importancia biológica de los resultados en este tipo de modelos simples in vitro de la mama humana es genes cuestionables y destinatarios identificados en estos modelos in vitro son difieren de los genes diana que se identifican en modelos animales 6. Cuando las células epiteliales de mama humano primario se cultivan in vitro tienden a perder la expresión del receptor de la hormona y por lo tanto la respuesta de la hormona 7,8. Este problema puede ser circumventd por enfoques sofisticados 3D utilizando matrigel. De esta manera, C. Clarke y sus colegas tuvieron éxito en el establecimiento de las células epiteliales de mama que mantenían la expresión del receptor de la hormona y mostraron una respuesta proliferativa a la estimulación de progesterona 9. Sin embargo, dos importantes in vivo genes diana de receptores de progesterona, Wnt-4 y RANKL, no fueron inducidos a la estimulación de progesterona en este sistema 9. Este enfoque fue recientemente tomada en más con in vitro </em&gt; pretratamiento hormonal y RANKL inducción se logró 10. Una advertencia permanece matrigel que tiene actividades que son dependientes de lotes, es caro, y exige un diseño experimental que es apto para sólo el número de células pequeñas. Sobre la base de la constatación de que en ER vivo y PR de señalización están en gran parte mediada por interacciones paracrinas 11, argumentamos que las interacciones intercelulares deben ser mantenidos. Otro factor importante que se pierde como tejidos se disocian a las células individuales para el cultivo in vitro son las interacciones de las células epiteliales con la matriz extracelular; sin embargo, éstos son críticos para la diferenciación del epitelio y su alteración es importante en la tumorigénesis 12. Con esto en mente, hemos establecido un método para aislar microestructuras de tejido de mama a partir de material de descarte quirúrgica fresco 13. El parénquima mamario, que consiste en un epitelio de dos capas con luminal interior y exterior myoepithelicélulas de Al, se diseca lejos de tejido adiposo y se someten a la disociación mecánica y enzimática. Después del lavado y centrifugación, se obtienen fragmentos de conductos de la leche que mantienen una estrecha interacción con muchas células del estroma. Estas microestructuras de tejido permanecen hormona sensible. El modelo fue validado en muestras clínicas 13. Como tal, el presente procedimiento puede ayudar a estudiar la acción hormonal en la mama en un contexto biológicamente y clínicamente relevante.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="877">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:164px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:260px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:335px;">Microlitre Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Heraeus Biofuge Fresco</td>
			<td style="width:119px;">75005521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Centrifuge 5810R</td>
			<td style="width:164px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5810 000.327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Cryobox</td>
			<td style="width:164px;">Nalgene&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:335px;">Controlled Rate Freezer EF600 Grant</td>
			<td style="width:164px;">Asymptote&#160;</td>
			<td style="width:119px;">EF600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:164px;">Hera Cell Heraeus</td>
			<td style="width:119px;">51022391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Roller Mixer SRT9D</td>
			<td style="width:164px;">Sturt</td>
			<td style="width:119px;">SRT9D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Histology Cassettes</td>
			<td style="width:164px;">Medizintechnik</td>
			<td style="width:119px;">81-0021-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Cell Strainer</td>
			<td style="width:164px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Strile Surgical Blade&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Aesculap</td>
			<td>BB536&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Scalpel</td>
			<td style="width:164px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">BB084R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Forceps</td>
			<td style="width:164px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">BD047R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Scissors</td>
			<td style="width:164px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">BC374R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Paraffin base mold</td>
			<td style="width:164px;">SAKURA</td>
			<td style="width:119px;">4166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix</td>
			<td style="width:164px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:119px;">6769006</td>
			<td style="width:260px;">Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">DMEM F/12</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td>Prewarm (37&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Collagenase</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11 088 793 001</td>
			<td>Prewarm (37&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10270</td>
			<td>Can be replaced with Fetal Calf Serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Cell Blood Lysis Buffer</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Agarose</td>
			<td style="width:164px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:164px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Isopentane</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M32631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Ethanol</td>
			<td style="width:164px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1009831000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Cryogenic vials (5.0ml)&#160;</td>
			<td style="width:164px;">VWR, International</td>
			<td style="width:119px;">479-0820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Ultra low attachment culture dish</td>
			<td style="width:164px;">Corning, NY 14831</td>
			<td style="width:119px;">3471</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo model to study hormone action in the human breast

El estudio de la acción de la hormona en el pecho humano se ha visto obstaculizada por la falta de sistemas de modelos adecuados. Tras el cultivo in vitro, las células epiteliales mamarias primarias tienden a perder la expresión del receptor de la hormona. Ampliamente receptor de la hormona líneas celulares de cáncer de mama positivo utilizados son de limitada relevancia para la situación in vivo. A continuación, describimos un modelo ex vivo para estudiar la acción de la hormona en el pecho humano. Muestras de tejido de mama humanos frescos a partir de material de descarte quirúrgica como mammoplasties reducción o mammectomies están mecánica y enzimáticamente digeridos para obtener fragmentos de tejidos que contienen conductos y los lobulillos y los múltiples tipos de células del estroma. Estas microestructuras de tejido mantenidas en medio basal sin factores de crecimiento conservan sus contactos intercelulares, la arquitectura de los tejidos, y siguen siendo sensible a hormonas durante varios días. Se procesan fácilmente para ARN y la extracción de proteínas, el análisis histológico o almacenadas en medio de congelación. Fluorescenciaclasificación de células activadas (FACS) puede usarse para enriquecer poblaciones de células específicas. Este protocolo proporciona un enfoque sencillo, estándar para estudios traslacionales con, variados especímenes humanos altamente complejos.

Para estudiar el papel de los estrógenos y la progesterona y para comprender mejor sus funciones moleculares en el pecho humano, recogemos frescas muestras de tejido de mama humanos de los pacientes sometidos a reducción mammoplasties (Figura 1) después de obtener su consentimiento informado. También obtenemos la historia médica y reproductiva de los pacientes, así como una muestra de sangre para determinar los niveles séricos de progesterona en el momento de la cirugía. El tejido de reducción ...

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An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Hemos desarrollado un nuevo modelo ex vivo para estudiar la acción de la hormona en el pecho humano. Se basa en microestructuras de tejido aisladas a partir de muestras de tejido de mama quirúrgicos que conservan la arquitectura del tejido, las interacciones intercelulares, y la señalización paracrina.

Una<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo para estudiar la acción hormonal en el pecho humano

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

11.3K vistas.  Ecole polytechnique fédérale de Lausanne.  Hemos desarrollado un nuevo modelo ex vivo para estudiar la acción de la hormona en el pecho humano. Se basa en microestructuras de tejido aisladas a partir de muestras de tejido de mama quirúrgicos que conservan la arquitectura del tejido, las interacciones intercelulares, y la señalización paracrina. 

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Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

Biomarcadores en un modelo animal para Revelar correlatos neurales, hematológicas y conductuales de estrés postraumático

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Investigación

Medicina

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Humanos neuroendocrinos líneas de células tumorales como un modelo tridimensional para el estudio de la terapia humana tumor neuroendocrino

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic lesions. Mouse models are an important tool to investigate inflammatory processes in atherogenesis, but these models suffer from the phenotypic and functional differences between the murine and human immune system. In vitro cell experiments are used to specifically evaluate cell type-dependent changes caused by a substance of interest, but culture-dependent variations and the inability to analyze the influence of specific molecules in the context of the inflammatory compound in atherosclerotic lesions limit the impact of the results. In addition, measuring levels of a molecule of interest in human blood helps to further investigate its clinical relevance, but this represents systemic and not local inflammation. Therefore, we here describe a plaque culture model to study human atherosclerotic lesion biology ex vivo. In short, fresh plaques are obtained from patients undergoing endarterectomy or coronary artery bypass grafting and stored in RPMI medium on ice until usage. The specimens are cut into small pieces followed by random distribution into a 48-well plate, containing RPMI medium in addition to a substance of interest such as cytokines or chemokines alone or in combination for defined periods of time. After incubation, the plaque pieces can be shock frozen for mRNA isolation, embedded in Paraffin or OCT for immunohistochemistry staining or smashed and lysed for western blotting. Furthermore, cells may be isolated from the plaque for flow cytometry analysis. In addition, supernatants can be collected for protein measurement by ELISA. In conclusion, the presented ex vivo model opens the possibility to further study inflammatory lesional biology, which may result in identification of novel disease mechanisms and therapeutic targets.

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process. This manuscript illustrates an easy to use ex vivo model to investigate fresh carotid or coronary artery plaques. The ex vivo model allows for the investigation of potential substances on the inflammatory milieu in human atherosclerotic lesions and results can be analyzed by various methods.

Un humano<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Placa aterosclerótica modelo para estudiar la lesión Biología

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Excitotóxica Estimulación del cerebro Microslices como<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Carrera

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren&#039;s Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

Humano Dupuytren<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura para el Estudio de miofibroblastos y matriz extracelular Interacciones

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little is known about breast cancer cell properties and behaviors within the native microenvironment of human bone tissue.We have developed approaches to track, quantify and modulate human breast cancer cells within the microenvironment of cultured human bone tissue fragments isolated from discarded femoral heads following total hip replacement surgeries. Using breast cancer cells engineered for luciferase and enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression, we are able to reproducibly quantitate migration and proliferation patterns using bioluminescence imaging (BLI), track cell interactions within the bone fragments using fluorescence microscopy, and evaluate breast cells after colonization with flow cytometry. The key advantages of this model include: 1) a native, architecturally intact tissue microenvironment that includes relevant human cell types, and 2) direct access to the microenvironment, which facilitates rapid quantitative and qualitative monitoring and perturbation of breast and bone cell properties, behaviors and interactions. A primary limitation, at present, is the finite viability of the tissue fragments, which confines the window of study to short-term culture. Applications of the model system include studying the basic biology of&#160;breast cancer and other bone-seeking malignancies within the metastatic niche, and developing therapeutic strategies to effectively target breast cancer cells in bone tissues.

Protocols are described for studying breast cancer cell migration, proliferation and colonization in a human bone tissue explant model system.

Métodos de explantes de tejidos El cultivo fémur humano para el Estudio de la colonización de la célula del cáncer de pecho de la Niche metastásico

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

En vivo y ex vivo para estudiar Cáncer de ovario metastásico colonización de Estructuras Vía lugar en Peritoneal adiposo

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

El agotamiento de las células de ratón a partir de xenoinjertos de tumores humanos mejora significativamente análisis de aguas abajo de las células diana

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to establish human enteroid ex vivo culture systems are important to model intestinal pathophysiology and to study the particular cellular responses involved. In recent years, enteroids from mice and humans are being cultured, passaged, and banked away for future use in several laboratories across the world. This enteroid platform can be used to test the effects of various treatments and drugs and what effects are exerted on different cell types in the intestine. Here, a protocol for establishing primary stem cell-derived small intestinal enteroids derived from neonatal mice and premature human intestine is provided. Moreover, this enteroid culture system was utilized to test the effects of species-specific breast milk. Mouse breast milk can be obtained efficiently using a modified human breast pump and expressed mouse milk can then be used for further research experiments. We now demonstrate the effects of expressed mouse, human, and donor breast milk on the growth and proliferation of enteroids derived from neonatal mice or premature human small intestine.

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

This protocol describes how to establish an enteroid culture system from neonatal mouse or premature human intestine as well as an efficient method to collect milk from mice.

La leche materna mejora el crecimiento de Enteroids: un modelo Ex Vivo de la proliferación celular

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medición de la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón con cable miografía

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...