Dieses Protokoll ermöglicht neuartige präklinische Tests der tumorspezifischen Hyperthermie in Kombination mit thermosensitiven Medikamenten, die zur Verbesserung des Überlebens und zur Verringerung der systemischen Toxizität bei Sarkompatienten eingesetzt werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Freisetzung der Chemotherapie auf die erhitzte Region beschränkt ist, wodurch die Wirkstofffreisetzung innerhalb des Tumors maximiert wird, während die systemische Freisetzung des Arzneimittels im gesunden Gewebe minimiert wird. Unsere Methoden können klinisch auf die Behandlung von Sarkomen übertragen werden.
Außerdem lernen wir, wie eine lokalisierte Hypothermie das Immunsystem anregen kann, um dem Körper zu helfen, Krebs neben der Standard-Chemotherapie zu bekämpfen. Das Verfahren wird von Dr. Warren Foltz, dem leitenden MRT-Physiker am Star Innovation Center, Dr. Adam Waspe, dem leitenden HIFU-Physiker am Hospital for Sick Children, und Suzanne Wong, einer Master-Absolventin in angewandten Wissenschaften vom Drake Lab am Hospital for Sick Children in Toronto, demonstriert. Rasieren Sie zunächst das Hinterbein der gefesselten Maus mit einer Haarschneidemaschine und wischen Sie es mit 70%igem Ethanol ab.
Aspirieren Sie ca. 10.000 Zellen in 10 Mikrolitern Zellsuspensionslösung mit einer Mikroliterspritze. Strecken Sie das rechte Hinterbein der Maus aus und injizieren Sie die Zellsuspension mit einer Mikroliterspritze mit einer 26-Gauge-Nadel in gleichmäßiger Bewegung in die Oberschenkelmuskulatur. Die Nadel sollte parallel zum Oberschenkelknochen in Richtung Knie eingeführt werden, wobei darauf zu achten ist, dass der Ischiasnerv nicht getroffen wird.
Entfernen Sie die Nadel und legen Sie die Maus in einen zweiten Käfig zurück. Untersuchen Sie die Tiere täglich und überwachen Sie ihre Hinterbeine durch Abtasten auf Tumorwachstum. Stellen Sie die anästhesierte Maus mit dem MRT-Scanner dar.
Notieren Sie sich auf dem T2-gewichteten Bild die einfachen Abmessungen und die Anzahl der axialen Schnitte, in denen der Tumor auftritt. Notieren Sie die Lokalisation des Tumors in Bezug auf den Femur und die laterale Oberfläche des Oberschenkels, in die die Ultraschallwelle eintreten würde. Um das HIFU-System mit kleinem Durchmesser vorzubereiten, schalten Sie den Generator ein, setzen Sie die Membran auf den Wandler und füllen Sie den Wandler mit ausreichend deionisiertem Wasser, bis sich die Membran unterhalb des Wandlers ausdehnt.
Aber nicht so fest, dass es die Maus komprimieren würde. Entgasen Sie das Wasser im Wandlerkreislauf für 30 Minuten, um gelösten Sauerstoff aus dem Medium zu entfernen. Nachdem Sie die Maus betäubt und in einen Nasenkegel übertragen haben, tragen Sie ein Hornhautgleitmittel auf die Augen auf, um Schäden durch den fehlenden Blinzelreflex unter Narkose zu vermeiden.
Rasieren Sie das rechte Hinterbein der Maus. Tragen Sie Enthaarungscreme auf die rasierte Stelle einschließlich des gesamten rechten Hinterbeins auf. Positionieren Sie die Maus unter einer Wärmelampe, während sie sich in der Biosicherheitswerkbank befindet, um die Wärmeregulierung zu unterstützen.
Und entfernen Sie die Haare und die Enthaarungscreme eine Minute nach dem Auftragen. Bewegen Sie die Maus zu einem MRT-kompatiblen Nasenkegel auf dem MRT-Schlitten und legen Sie die Maus mit der nicht tumortragenden Seite nach unten und dem Tumor superior in einen 3D-gedruckten Maushalter auf dem Schlitten. Platzieren Sie eine Wärmelampe in der Nähe der Maus, um sie warm zu halten.
Schneiden Sie bei Bedarf ein komprimiertes Ultraschall-Gelpad-Segment zu, um die Unterseite des Halters mit einer Dicke unter die Maus zu legen, um den Tumor auf die Oberseite des Halters auszurichten. Stecken Sie das unbeteiligte Bein vom Tumorbein weg, entweder unter der Maus oder gestreckt mit gebeugtem Tumorbein. Stellen Sie sicher, dass sich die Füße nicht im Nah- oder Fernfeld des Tumor- und Ultraschallstrahlengangs befinden.
Um den Ösophagustemperaturfühler einzuführen, fädeln Sie die Speiseröhrensonde durch den Nasenkegel und schrubben Sie den Hals der Maus ab. Neige die Nase der Maus nach oben, um eine Linie vom Maul direkt zum Bauch zu ziehen, indem du den Kopf streckst. Schieben Sie die Wärmesonde etwa 0,5 Zentimeter über die Zunge in die Speiseröhre der Maus und setzen Sie den Nasenkegel wieder um die Nase der Maus ein.
Befestigen Sie die Speiseröhrensonde und den Nasenkegel an der Oberseite des Schlittens. Führen Sie als Nächstes den rektalen Temperaturfühler ein und befestigen Sie ihn mit Klebeband. Setzen Sie bei Bedarf ein weiteres Gelkissen ein und tragen Sie Augengleitmittel oder Ultraschallgel um die rechte Hintergliedmaße auf, um eventuelle Lücken zu füllen.
Führen Sie einen 27-Gauge-Schmetterlingsnadel-Schwanzvenenkatheter in eine seitliche Schwanzvene ein, die an einem Mikroschlauch mit 40 Mikrolitern Totraum befestigt ist, und kleben Sie ihn sicher ab. Platzieren Sie den Atemmonitor mit dem Verbindungskabel in Richtung des Mauskopfes, damit er die Platzierung des Ultraschallwandlers nicht stört, und sichern Sie ihn mit Klebeband. Tragen Sie die vorbereitete Maus, den Mausschlitten, den Anästhesieschlauch, den Beatmungsschlauch, den Schwanzvenenkatheter und die Wärmesondenschnüre zu zweit in den MRT-Scanner und legen Sie sie in den MRT-Schlittenhalter.
Alle wurden untersucht und es wird nichts in den MR-Raum gebracht, was ferromagnetisch ist oder durch das starke Magnetfeld des Systems beschädigt werden könnte. Nachdem der Bediener der HIFU-Software den Meniskus des Schallkopfs für eine erste Ausrichtung direkt über den Tumor bewegt hat, tragen Sie Augengleitmittel oder entgastes Ultraschallgel auf die haarlose Haut über dem Tumor auf und koppeln Sie den HIFU-Schallkopf mit dem Tumorbereich. Schließen Sie die Medikamentenabgabeleitung von der automatischen Pumpe an den Schwanzvenenkatheter an und berechnen Sie den Totraum in der Schwanzvenenleitung und der Verbindungsleitung.
Schieben Sie den Maus-HIFU-Schlitten auf MRT-Schienen in die Mitte des MRT und stellen Sie das Luftkonvektionswärmegerät auf die wärmste Einstellung. Richten Sie den Schlauch, der Luft in die Mitte der MRT-Bohrung bläst, auf die Maus und befestigen Sie sie mit Klebeband. Das Aufwärmgerät wird später auf die niedrigste Stufe gedreht, um eine Überhitzung der Maus während der Beschallung zu vermeiden.
Erfassen Sie die MRT-Bilder der Untersuchung sowohl axial als auch sagittal, um die Tumorposition für die Beschallung zu bestimmen, einschließlich der Tiefe. Passen Sie die Position des Gebers mit der HIFU-Software entsprechend an, indem Sie den gewünschten Bewegungsabstand eingeben, der auf dem Bild gemessen wird, und dann auf die Pfeilrichtung klicken, um sich zu bewegen. Beachten Sie auch die Position des Driftrohrs.
Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf. Bestimmen Sie die Position des Brennflecks des Schallkopfs in der Hornhautebene, indem Sie während der Aufnahme der Testschussthermometrie fünf Sekunden lang eine kurze kontinuierliche 50-Millivolt-Testschussbeschallung durchführen. Richten Sie die MR-Survey-Bilder mit der Hornhautansicht des Brennflecks in der HIFU-Software aus.
Überprüfen Sie die Bilder auf die Lokalisation des Tumors in Bezug auf die knöcherne Struktur und das Rektum und überprüfen Sie die Positionierung des Schallkopfs nach Bedarf. Wiederholen Sie die Testbeschallung während der Wärmebildgebung mit neun Wiederholungen, um zu bestätigen, ob eine gleichmäßige und genaue Erwärmung des Tumorvolumens mit minimaler Off-Target-Erwärmung vorliegt. Passen Sie die Scheibenposition, die Position des Wandlers und die Tiefe der Lenkung an und bestätigen Sie die Heizleistung bei Bedarf mit wiederholten Testaufnahmen.
Definieren Sie mit der HIFU-Behandlungsüberwachungssoftware den Bereich of Interest oder ROI für die thermometrische Überwachung innerhalb des endgültigen Heizprofils, indem Sie den zu bewegenden Abstand messen und dann die Rasterkoordinaten im Programm ändern. Stellen Sie einen ROI innerhalb des Flüssigkeitssignals vom Driftrohr ein, um die Driftkorrektur des Thermometrieausgangs zu korrigieren. Wenn dieses Flüssigkeitssignal innerhalb des axialen Planungsbildes auf der Ebene des Tumors nicht gut definiert ist, wird der direkte Ausgang des faseroptischen Temperaturfühlers innerhalb des Driftrohrs zur Driftkorrektur verwendet.
Geben Sie die Basistemperatur basierend auf der Temperatur der rektalen Sonde für thermometrische Messungen ein. Öffnen Sie die 20-Minuten-Hyperthermie-Behandlungsspezifikationen in der Software und starten Sie die Beschallung, sobald die Referenz-MRT-Bilder erfasst wurden und die Thermometrie beginnt. Führen Sie eine 20-minütige Behandlung während der Wärmebildgebung mit der integrierten PID-Reglersoftware (Proportional Integrative Derivat) durch.
Injizieren Sie das ausgewählte Medikament 1,5 Minuten, nachdem sich die Temperatur im ROI auf die gewünschte Temperatur erwärmt hat. Wenn die rektale Temperatur während der Behandlung schnell ansteigt und 40 Grad Celsius überschreitet, stoppen Sie die Beschallung und lassen Sie die rektale Temperatur sinken, bevor Sie den Vorgang wieder aufnehmen. Entfernen Sie die Maus nach Abschluss der Behandlung aus der MRT-Bohrung, stellen Sie die Hämostase an der Einstichstelle des Schwanzvenenkatheters sicher und übergeben Sie sie in die Biosicherheitswerkbank.
Waschen Sie das Ultraschallgel und das Gleitmittel mit Wasser vom Hinterbein ab. Legen Sie die Maus in ihren Käfig und überwachen Sie ihre Wiederherstellung. Richten Sie die Wärmelampe auf ein Ende des Käfigs, um die Wärmeregulierung während der Genesung zu unterstützen.
Mit Hilfe dieses Hyperthermie-Protokolls konnten die Tumore in der Hintergliedmaße für die Dauer der Behandlung konstant auf die gewünschte eingestellte Temperatur erhitzt werden. Die Temperatur, die während der repräsentativen Behandlung überwacht wird, ist in dieser Abbildung dargestellt. Die durchschnittlichen Temperaturen des oberen 10. Perzentils und des oberen 90. Perzentils aller Voxel im ROI werden hier dargestellt.
Die durchschnittlichen Temperaturen während der Behandlung innerhalb des ROI für jede Maus wurden während der Optimierungsphase mit der Standardabweichung getestet. Die durchschnittliche Gesamttemperatur wird ebenfalls angezeigt. Auch die Erfolgsraten der Hyperthermiebehandlung verbesserten sich im Laufe der Zeit.
Der Behandlungserfolg war abhängig von den Einschlusskriterien. Das ist die systemische Temperatur, die Tumortemperatur und die Variation mit dem ROI und keine distale Erwärmung. Hier steht die blaue Linie für den Prozentsatz der Mäuse, bei denen die Behandlung erfolgreich war, und die orangefarbenen Balken für die Anzahl der behandelten Mäuse.
Jede Behandlung bezieht sich auf ein separates Datum, an dem die Experimente durchgeführt wurden. Um die optimale Hypothermie-Behandlungszeit für weitere Studien zu bestimmen, wurden zwei Behandlungsdauern getestet, 10 Minuten und 20 Minuten. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie (HPLC MS) wurde verwendet, um die Menge an Doxorubicin in den Tumoren zu beurteilen und den Unterschied in der Doxorubicin-Akkumulation zwischen den getesteten Zeiträumen zu quantifizieren.
Die Ergebnisse zeigen die Signifikanz zwischen der Menge an Doxorubicin im Tumor in der 20-minütigen thermosensitiven liposomalen Doxorubicin-plus-Hyperthermie-Gruppe im Vergleich zur normalen Thermiekontrolle. Es wurden keine Unterschiede im Tumor in den freien Doxorubicin-Gruppen festgestellt. Bei der Vorbereitung und Positionierung der Masse ist es zwingend erforderlich, dass der HIFU-Strahl frei von Hindernissen ist.
Luftblasen im Gel oder Knochen im Strahlengang müssen vermieden werden. Wir entnehmen Gewebe und Blut, um die Pharmakokinetik und Toxizität in verschiedenen Organen zu analysieren und die unmittelbare und verzögerte Reaktion des Immunsystems auf die Behandlung zu untersuchen.
