Interrogar los perfiles bioenergéticos en tiempo real de oxphos y glucólisis está emergiendo como un factor clave en la caracterización de la salud y función del EPR. La respirometría de alta resolución permite una forma eficiente de comparar el estado metabólico del EPR normal y enfermo. Esta técnica tiene la ventaja de la exploración simultánea tanto de oxphos como de glucólisis a través de una medición de la tasa de consumo de oxígeno, OCR y tasa de acidificación extracelular, ECAR.
Las células del EPR son células metabólicamente activas y son una de las primeras células en degenerar durante la DMAE. Comprender su función metabólica y mitocondrial permite desarrollar nuevos fármacos. Para comenzar, agregue 100 microlitros por pocillo de la suspensión celular en el medio RPE humano a una concentración final de 20, 000 células por 100 microlitros en cada pocillo.
Y asegúrese de dejar vacíos los pozos de las cuatro esquinas. Pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para garantizar una suspensión celular homogénea, utilizando una pipeta multicanal para mayor facilidad y consistencia. Agregue 100 microlitros de medios solo a los cuatro pocillos de esquina vacíos para la corrección de fondo.
Deje la placa de cultivo celular a temperatura ambiente durante una hora para ayudar a minimizar los efectos de borde. Luego colóquelo en la incubadora con 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados y humidifiquelo. Después de la incubación durante la noche, examine las células bajo el microscopio para verificar su morfología y nivel de pigmentación antes de cambiar el medio.
En los días de examen posteriores, asegúrese de que las células sean confluentes con una morfología característica similar a un adoquín y adquieran pigmentación con el tiempo. Para garantizar la hidratación del cartucho sensor el día anterior al ensayo, llene cada pocillo de la placa de utilidad con 200 microlitros de agua desionizada y coloque el cartucho del sensor, sumergido en agua en la placa de utilidad. Mantenga aproximadamente 20 mililitros de la solución calibrante durante la noche en un horno humidificado de 37 grados centígrados sin dióxido de carbono.
Encienda el instrumento de respirometría de alta resolución e inicie el software para permitir que el instrumento se estabilice a 37 grados centígrados durante la noche. El día del ensayo, reemplace el agua en la placa de utilidad con un volumen igual de solución calibrante calentada al menos 45 minutos antes de ejecutar el ensayo. Calentar 25 mililitros del medio de ensayo de prueba de esfuerzo Mito preparado sin rojo fenol a 37 grados centígrados y filtrar al vacío el medio ajustado pH 7.4, utilizando una unidad de filtro superior de tubo.
Retire los medios RPE humanos de la placa de cultivo celular y agregue 100 microlitros de medios de ensayo recién preparados. Luego coloque la placa de cultivo celular en un horno humidificado a 37 grados centígrados sin dióxido de carbono durante una hora antes de comenzar el ensayo. Cada cartucho sensor tiene cuatro puertos de suministro de reactivos por pocillo para inyectar los compuestos de prueba en pocillos de placa de cultivo celular durante el ensayo.
Prepare tres mililitros de las soluciones de medicamentos Tenex cada uno, diluyendo las existencias de medicamentos en sus respectivos medios de ensayo. A continuación, pipetear 20 microlitros de la reserva de fármaco Tenex en el puerto A, 22 microlitros en el puerto B y 25 microlitros en el puerto C para lograr la concentración final especificada del fármaco en cada pozo. A continuación, en el software de análisis, abra la pestaña de plantillas, seleccione la prueba de esfuerzo Mito y complete las definiciones de grupo.
Detalles de entrada sobre la estrategia de inyección para los medicamentos de prueba de esfuerzo Mito. Luego ingrese detalles sobre los diferentes grupos experimentales en el ensayo para control o tratamiento. Detalles de entrada en los medios de ensayo para agregar diferentes suplementos y sus concentraciones específicas al medio de ensayo base.
Y finalmente, agregue el tipo de celda. Haga clic en la siguiente pestaña y luego en Mapa de placas para asignar diferentes grupos bajo examen a su ubicación específica en la placa de pozo 96. Al completar el mapa de placas, haga clic en la pestaña de protocolo para revisar el protocolo de instrumento para el protocolo de prueba de esfuerzo Mito predeterminado.
Luego haga clic en ejecutar el ensayo e inserte el cartucho del sensor, sumergido en la solución calibrante en la placa de utilidad para la calibración. Este proceso dura alrededor de 25 minutos y cada biosensor se calibra de forma independiente, en función de la salida del sensor medida en la solución calibrante de pH y concentración de oxígeno conocidos. Al finalizar la calibración, retire la placa de utilidad e inserte la placa de cultivo celular.
Después de la medición de referencia, el instrumento inyecta automáticamente la solución de fármaco del Puerto A en cada pocillo que sigue tres bucles de mezcla y medición, tres minutos cada uno. El mismo patrón ocurre después de cada inyección de droga posterior en los otros puertos. Una vez completada la ejecución, retire la placa de cultivo celular y el cartucho del sensor.
Para fines de control de calidad, asegúrese de que todos los puertos del medicamento y el cartucho del sensor se hayan inyectado examinando los puertos para detectar que no queden restos de fármaco residual. A continuación, examine las células en la microplaca de cultivo celular bajo el microscopio para asegurar la monocapa confluente de células. Luego deseche los medios de ensayo y reemplácelos con 60 microlitros de un tampón de lisis x en cada pocillo.
Envuelva los bordes de la placa en parafilm para evitar la evaporación y colóquela en un congelador de menos 80 grados centígrados para ayudar en la lisis celular durante la noche antes de la cuantificación del contenido de proteína, utilizando el ensayo BCA. Según el análisis de datos, normalice todos los datos dividiendo la tasa de consumo de oxígeno u OCR y la tasa de acidificación extracelular o los valores de ECAR por los microgramos de proteína en cada pocillo. A continuación, exporte el generador de informes de prueba de esfuerzo de Mito, que utiliza macros de Excel para calcular automáticamente los parámetros de la prueba de esfuerzo de Mito utilizando el software de análisis de datos.
Siguiendo los mismos pasos que se demostraron para la prueba de esfuerzo de Mito, se puede realizar la prueba de esfuerzo glucolítico, excepto para los suplementos de medios de ensayo y las inyecciones de medicamentos que son diferentes como se muestra en la tabla uno y la tabla dos. El instrumento mide simultáneamente OCR y ECAR para cada ejecución. Para la prueba de esfuerzo de Mito, los cálculos perimetrales se basan en lecturas de OCAR, mientras que para la prueba de esfuerzo glucolítico, los cálculos de parámetros se basan en lecturas de ECAR.
Aquí hay una curva de OCR generada al realizar la prueba de esfuerzo de Mito en células RPE humanas primarias. Los cálculos de los parámetros de la prueba de esfuerzo de Mito se muestran como gráficos de barras. Del mismo modo, esta es la curva ECAR, generada a partir de la realización de la prueba de esfuerzo glucolítico en células RPE humanas primarias y los cálculos se muestran como gráficos de barras.
Para optimizar la inyección del fármaco puerto B para la prueba de esfuerzo de Mito, se comparó la eficacia de dos agentes de desacoplamiento en el aumento de OCR en células RPE humanas primarias. Se encontró que BAM15 era superior a FCCP en la mejora de la capacidad respiratoria mitocondrial como se ve por la respiración máxima significativamente mayor y la capacidad respiratoria de repuesto con BAM15, en comparación con FCCP. Es importante recordar hidratar el cartucho del sensor el día antes de ejecutar el ensayo.
Esta técnica permite a los investigadores caracterizar mejor los perfiles bioenergéticos de las células del EPR y comprender cómo las células del EPR exhiben flexibilidad metabólica en respuesta a diferentes estímulos patógenos.
