Estos protocolos permiten a los investigadores ir más allá de la simple medición del consumo de oxígeno mitocondrial, y en su lugar permiten la medición de productos finales mitocondriales clave, ATP y especies reactivas de oxígeno. La principal ventaja de esta técnica es que el investigador puede medir la eficiencia mitocondrial comparando directamente la tasa de consumo de oxígeno con la tasa de producción del producto final. Si el producto final es ATP u oxígeno reactivo.
Las técnicas requieren una atención muy cuidadosa a los detalles, particularmente para evitar burbujas. Ya sea que estén en la cámara de respiración o en las jeringas de titulación, las burbujas son su enemigo porque hacen que las mediciones sean menos precisas. Después de obtener las biopsias del músculo esquelético.
Llene las cámaras del respirómetro con medios libres de magnesio y selle la cámara de incubación. Ajuste la temperatura de incubación del instrumento a 38 grados centígrados para representar la temperatura basal del músculo esquelético equino. Y ajuste la mezcla de los medios respiratorios a 750 rpm usando un movimiento magnético girando en la parte inferior de la cámara del respirómetro.
A continuación, apague la iluminación de la cámara para evitar interferencias con los sensores fluorescentes. Energize el electrodo de oxígeno con un voltaje de polarización de 800 milivoltios y amplifique la señal resultante con un ajuste de ganancia de uno. Registre la concentración de oxígeno cada dos segundos y calcule el flujo de oxígeno como la pendiente negativa de la medición de oxígeno durante los 40 segundos siguientes.
Luego calibre el sensor de oxígeno permitiendo que el medio se equilibre con el aire ambiente. Calcular la presión parcial de oxígeno de referencia basada en la presión barométrica medida por el respirómetro de alta resolución y la concentración estándar de oxígeno atmosférico. Utilice sensores fluorescentes verdes para cuantificar la señal fluorescente de la cámara de respiración.
Energize los sensores a 400 a 500 milivoltios y la señal resultante se amplifica con una ganancia de 1 a 1, 000. A continuación, agregue TMRM a la cámara de respiración antes de agregar mitocondrias y calibre la señal fluorescente utilizando una calibración simple de dos puntos de la señal fluorescente frente a la cantidad de fluoróforo agregado antes de la adición de las mitocondrias. Realizar la calibración final de la señal TMRM después de completar el protocolo de titulación de respirometría mediante la entrega de varias valoraciones del agente de desacoplamiento hasta que no se observen aumentos adicionales en la señal fluorescente TMRM que indiquen el colapso completo del potencial de la membrana mitocondrial.
Utilice sensores fluorescentes azules para cuantificar la señal fluorescente de la cámara de respiración y energizar estos sensores para que los instrumentos individuales capturen la señal esperada dentro del rango lineal del sensor. Agregue ocho microlitros de dos milimolares EDTA a la cámara respiratoria para quelar cationes que competirían con los iones de magnesio para unirse al verde de magnesio. Luego, agregue cuatro microlitros de un verde de magnesio milimolar a la cámara de respiración.
Calibre la señal fluorescente cruda con valoraciones secuenciales de 10 por 2 microlitros de cloruro de magnesio milimolar, permitiendo un minuto entre valoraciones para estabilizar la señal fluorescente. Determine la tasa de síntesis de ATTP, que es la pendiente de la concentración de ATP a lo largo del tiempo a lo largo del protocolo. Utilice sensores fluorescentes verdes para cuantificar la señal fluorescente de la cámara de respiración.
Energize los sensores a 300 a 400 milivoltios. Y la señal resultante se amplifica con una ganancia de 1 a 1, 000. Optimice los ajustes específicos de instrumentos individuales para capturar la señal esperada dentro del rango lineal del sensor.
Antes de agregar las mitocondrias, realice la configuración química y la calibración inicial del ensayo Amplex UltraRed. Agregue 30 micromoles de DTPA para quelar cationes que puedan interferir con la reacción. Luego agregue superóxido dismutasa o serratus peroxidasa y Amplex UltraRed en la cámara de respirometría.
Permita que la señal fluorescente se estabilice. Luego agregue 0.2 micromoles de peróxido de hidrógeno dos veces con un espacio de cinco minutos. Realice calibraciones adicionales de dos puntos a lo largo del ensayo para permitir el ajuste de la capacidad de respuesta del ensayo a medida que la química de la respirometría cambia a lo largo del ensayo con el tiempo específico de estos puntos de calibración a discreción del investigador.
Vortex la muestra para mantener una suspensión de muestra uniforme y agregar 15 microlitros de suspensión mitocondrial aislada a cada cámara de incubación de dos mililitros para que los resultados representen el rendimiento mitocondrial de 18.75 miligramos de músculo. Antes de agregar cualquier sustrato, mida el consumo de oxígeno residual y reste este valor de los valores de consumo de oxígeno de cada paso en la titulación del inhibidor desacoplado del sustrato o el protocolo SUIT después de la finalización. Utilice un SUIT de propósito general que permita la caracterización inicial de la función mitocondrial del músculo esquelético equino.
Comience con titulaciones secuenciales de piruvato, glutamato y malato entre sí en cada cámara para producir nicotinamida adenina dinucleótido y estimular la respiración no fosforilante apoyada por NADH oxidado a través de una fuga compleja de una sola base. Luego agregue ADP para estimular la respiración fosforilante a través de la respiración fosforilante compleja uno. Agregue succinato para producir respiración fosforilante combinando la respiración fosforilante del complejo uno y el complejo dos Agregue rotenona para bloquear el complejo uno.
El flujo de oxígeno resultante representa la capacidad del complejo dos para apoyar el consumo de oxígeno mitocondrial por la oxidación del succinato solo. Se muestra un rastro de respirometría de alta resolución de la respiración mitocondrial del músculo esquelético equino y el potencial relativo de la membrana. Los valores respiratorios de las mitocondrias incubadas con TMRM son más bajos debido a un efecto inhibitorio de ese fluoróforo.
Se muestra la respiración mitocondrial y la síntesis de ATTP del músculo esquelético equino que contiene un alto porcentaje de fibras musculares esqueléticas tipo uno ricas en mitocondrias e incubadas en condiciones que se aproximan al metabolismo en reposo. Se muestra el rastro de respirometría de la respiración mitocondrial del músculo esquelético equino y la producción de peróxido de hidrógeno. La respirometría de alta resolución requiere mucha paciencia.
La persona que ejecuta el ensayo tendrá numerosos puntos de tiempo en los que necesita hacer una llamada de juicio con respecto a si se ha alcanzado un estado estacionario y puede ocurrir el siguiente paso. Solo hemos demostrado un único protocolo de valoración. Hay docenas de protocolos más que se pueden aplicar de la misma manera para abordar preguntas específicas sobre el metabolismo mitocondrial.
