Este protocolo permite a los investigadores identificar si la actividad de la caspasa ocurre junto con la muerte celular, identificando así diferentes modos de muerte celular. La ventaja de esta técnica es la flexibilidad para evaluar la actividad de la caspasa en un ensayo basado en la población o en una sola célula. Demostrando el procedimiento estarán Stefanie Rufli, graduada de doctorado, y Jing Tong, estudiante de doctorado visitante del laboratorio de Wendy Wei-Lynn Wong.
Después de diferenciar y cosechar los macrófagos derivados de la médula ósea o BMDM como se describe en el manuscrito, sembrarlos en una placa de seis pocillos a la densidad de una vez 10 a la sexta células por mililitro. Tratar las células con SMAC mimético durante 16 horas. Para preparar el lisado celular, transfiera la placa que contiene las células tratadas al hielo y recoja el medio de cultivo celular en un tubo de 1,5 mililitros.
Centrifugar a 300 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Aspire el medio y coloque el tubo en hielo. Luego agregue un mililitro de PBS frío a la placa de cultivo celular para lavar las células.
Después de aspirar todo el PBS, agregue 100 microlitros de tripsina a las células. Una vez que las células se separan de la placa, recójalas en el tubo de 1.5 mililitros. Después de centrifugar la suspensión celular, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en tampón de lisis DISC de 100 microlitros.
Incubar la muestra en hielo durante 20 minutos y luego centrifugar el lisado para granular la fracción insoluble. Transfiera 25 microlitros de lisado a una placa blanca de fondo plano de 96 pocillos para el ensayo de actividad caspasa-3/7 y 10 microlitros a una placa transparente de fondo plano de 96 pocillos para el ensayo de ácido bicinchonínico o BCA. Para la cuantificación de proteínas, prepare un rango de concentraciones séricas de albúmina bovina o BSA como proteína estándar.
Una vez que se agrega BSA estándar a la placa de fondo plano de 96 pocillos que contiene las muestras, mezcle los reactivos BCA uno y dos en una proporción de 50 a uno y agregue 200 microlitros a cada muestra en estándar. Después de incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos, mida la absorbancia a 562 nanómetros en un instrumento fluorométrico y cuantifique la concentración de proteína con la curva estándar. Para realizar un ensayo basado en la población, encienda el instrumento fluorométrico y caliente la máquina a 30 grados centígrados.
Establezca la longitud de onda de excitación y emisión en 360 y 465 nanómetros respectivamente. Luego prepare una mezcla de reacción maestra en hielo como se describe en el manuscrito para determinar la actividad de la caspasa. Agregue 75 microlitros de la mezcla a cada muestra y estándar para obtener un volumen de reacción total de 100 microlitros.
Mida inmediatamente la fluorescencia utilizando la configuración del instrumento fluorométrico y registre lecturas individuales cada minuto durante 40 minutos para determinar la cinética de reacción. Después de la siembra, cosechar las células adherentes como se demostró previamente en un tubo de poliestireno de cinco mililitros. Luego centrifugar la muestra a 300 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, y retirar el sobrenadante.
Para preparar la mezcla de tinción, tome un microlitro del sustrato fluorogénico y dilúyalo con 150 microlitros de PBS. Agregue 50 microlitros de mezcla de tinción por muestra, incube en la oscuridad a 37 grados centígrados durante 30 minutos y mezcle cada 15 minutos. En este ensayo poblacional, los datos representativos del ensayo cinético para la actividad de caspasa-3/7 mostraron un aumento de la escisión del sustrato con una mayor concentración mimética de SMAC.
Sin embargo, el aumento a una concentración de 500 nanomolares fue insignificante basado en un ANOVA unidireccional ordinario con múltiples comparaciones. El análisis de la actividad de la caspasa-3/7 utilizando citometría de flujo indicó un cambio en la fluorescencia para las células tratadas con miméticos SMAC en comparación con las células no tratadas, lo que también fue evidente en la intensidad de fluorescencia mediana trazada y el aumento a 500 concentración nanomolar fue significativo. El procedimiento debe realizarse en hielo.
Sin embargo, en el ensayo basado en la población, las muestras no se pueden dejar en hielo indefinidamente. Después de la etapa de lisis, las muestras deben procesarse o congelarse inmediatamente. La obtención de imágenes de la actividad de la caspasa utilizando microscopía de células vivas sería un método adicional para obtener información cinética a nivel de una sola célula.
