이 프로토콜을 통해 연구자들은 카스파아제 활성이 세포 사멸과 함께 발생하는지 확인하여 다양한 세포 사멸 모드를 식별할 수 있습니다. 이 기술의 장점은 집단 기반 분석 또는 단일 세포에서 카스파아제 활성을 평가할 수 있는 유연성입니다. 이 절차를 시연하는 것은 박사 과정 졸업생 인 Stefanie Rufli와 Wendy Wei-Lynn Wong의 실험실에서 방문 박사 과정 학생 인 Jing Tong이 될 것입니다.
원고에 기재된 바와 같이 골수 유래 대식세포 또는 BMDM을 분화 및 수확한 후, 이를 6-웰 플레이트에 밀리리터당 10 내지 6번째 세포의 밀도로 시드하였다. 세포를 SMAC 모조물로 16시간 동안 처리한다. 세포 용해물을 준비하기 위해, 처리된 세포가 들어 있는 플레이트를 얼음 상에 옮기고 세포 배양 배지를 1.5 밀리리터 튜브에 수집한다.
섭씨 4도에서 5 분 동안 300G에서 원심 분리합니다. 매체를 흡인하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 세포 배양 접시에 차가운 PBS 1 밀리리터를 추가하여 세포를 세척합니다.
모든 PBS를 흡인 한 후 100 마이크로 리터의 트립신을 세포에 첨가하십시오. 세포가 플레이트에서 분리되면 1.5 밀리리터 튜브에 모으십시오. 세포 현탁액을 원심분리한 후, 상청액을 제거하고, 펠렛을 100 마이크로리터의 DISC 용해 완충액에 재현탁시킨다.
샘플을 얼음 위에서 20분 동안 배양한 다음, 용해물을 원심분리하여 불용성 분획을 펠렛화한다. 25 마이크로리터의 용해물을 caspase-3/7 활성 분석을 위해 바닥이 평평한 흰색 96웰 플레이트로 옮기고 10마이크로리터를 비신코닌산 또는 BCA 분석을 위해 투명한 평평한 바닥 96웰 플레이트로 옮깁니다. 단백질 정량화를 위해 다양한 소 혈청 알부민 또는 BSA 농도를 표준 단백질로 준비합니다.
표준 BSA가 샘플이 들어 있는 평평한 바닥의 96웰 플레이트에 추가되면 BCA 시약 1과 2를 50:1의 비율로 혼합하고 표준의 각 샘플에 200마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 30분 동안 배양한 후 형광 측정 기기에서 562나노미터에서 흡광도를 측정하고 표준 곡선으로 단백질 농도를 정량화합니다. 인구 기반 분석을 수행하려면 형광 측정 기기를 시작하고 기계를 섭씨 30도까지 가열하십시오.
여기 및 방출 파장을 각각 360 및 465 나노미터로 설정합니다. 그런 다음 카스파제 활성을 결정하기 위해 원고에 설명된 대로 얼음 위에서 마스터 반응 혼합물을 준비합니다. 75 마이크로리터의 혼합물을 각 샘플 및 표준물질에 첨가하여 100 마이크로리터의 총 반응 부피를 수득한다.
형광 측정 기기 설정을 사용하여 형광을 즉시 측정하고 40분 동안 매분 개별 판독값을 기록하여 반응 역학을 결정합니다. 파종 후, 이전에 입증 된대로 부착 세포를 5 밀리리터 폴리스티렌 튜브에 수확합니다. 이어서 샘플을 섭씨 4도에서 5분 동안 300G에서 원심분리하고, 상청액을 제거한다.
염색 혼합물을 준비하려면 1 마이크로 리터의 플루오로 생성 기질을 취하여 150 마이크로 리터의 PBS로 희석하십시오. 샘플당 50마이크로리터의 염색 혼합물을 추가하고 섭씨 37도의 어둠 속에서 30분 동안 배양한 다음 15분마다 혼합합니다. 이 집단-기반 분석에서, 카스파제-3/7 활성에 대한 동역학 분석의 대표적인 데이터는 증가된 SMAC 모방 농도에 따라 증가된 기질 절단을 나타내었다.
그러나 500 나노 몰 농도에서의 증가는 다중 비교가있는 일반적인 일원 분산 분석을 기반으로 중요하지 않았습니다. 유동 세포분석을 사용한 caspase-3/7 활성의 분석은 SMAC 모방체로 처리된 세포에 대한 형광의 이동을 처리되지 않은 세포와 비교하여 나타내었으며, 이는 플롯된 중앙값 형광 강도에서도 분명했으며 500나노몰 농도에서의 증가는 유의했습니다. 절차는 얼음 위에서 수행해야합니다.
그러나 인구 기반 분석에서 샘플을 얼음 위에 무기한으로 남겨 둘 수는 없습니다. 용해 단계 후에 샘플을 즉시 추가 처리하거나 냉동해야 합니다. 라이브 셀 현미경을 사용하여 카스파제 활성을 이미징하는 것은 단일 세포 수준에서 동역학 정보를 얻는 추가 방법이 될 것입니다.
