La citometría de flujo es una técnica potente que permite el análisis multiparamétrico de células individuales. Puede identificar biomarcadores de apoptosis temprana y tardía con precisión y rapidez mediante el análisis de millones de células. Múltiples moléculas celulares se tiñen y se detectan simultáneamente.
En particular, la citometría de flujo de sobremesa permite el análisis y la interpretación por parte de citadores de flujo no expertos. Demostrando el procedimiento estará Esther Zhou, una estudiante de posgrado del grupo de cáncer de vitamina D. Comience cultivando los cultivos celulares en un ambiente humidificado de CO2 a 37 grados centígrados con 5% de CO2.
Asegúrese de que el cultivo celular sea aproximadamente 70% confluente en el matraz original antes de pasar las células para experimentos. Retirar el medio del matraz y lavar las células con 1X PBS. Luego agregue un mililitro de tripsina para separar las células.
Después de que las células comiencen a desprenderse, neutralice la tripsina agregando aproximadamente cinco mililitros de medio de cultivo fresco suplementado con 10% de suero fetal de ternera antes de contar las células. Células semilla a 15, 000 células por mililitro en tres mililitros de medio de cultivo celular en una placa de cultivo celular de seis pocillos. Incubar las placas de cultivo durante la noche a 37 grados centígrados con 5% de CO2 para permitir la unión de las células al fondo del pozo.
Al día siguiente, tratar los cultivos experimentales con 100 nanogramos por mililitro de actinomicina D y los controles de medio y disolvente con medio de cultivo fresco y DMSO, respectivamente, durante 24 horas. Retire el medio de los pozos y recoja el medio gastado en un tubo de 15 mililitros. Lave las celdas con 1X PBS.
Agregue 500 microlitros de tripsina para separar las células. Pipetear suavemente un mililitro de mediano dos o tres veces para desalojar mecánicamente las células restantes aún unidas al fondo del pozo. Agregue la solución de los pocillos en un tubo de 15 mililitros y luego agregue cinco mililitros de medio de cultivo fresco para neutralizar la tripsina.
Pipetear 450 microlitros de reactivo que contiene colorantes de unión al ADN en un tubo de microcentrífuga. Agregue 50 microlitros de la suspensión celular al tubo de microcentrífuga. Incubar el tubo a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Enumerar las células por citometría de flujo. Diluir todas las muestras a una concentración de una vez 10 a la sexta células por mililitro con medio de cultivo celular antes de proceder a los ensayos de apoptosis. Para detectar la externalización de fosfatidilserina usando una anexina V, agregue 100 microlitros de suspensión celular en un tubo de microcentrífuga.
A eso, agregue 100 microlitros de una mezcla 1: 1 de anexina V conjugada fluorescente y reactivo 7-AAD. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos, protegido de la luz. Para el análisis de la despolarización de la membrana mitocondrial, comience centrifugando 100 microlitros de la suspensión celular a 300 veces G durante cinco minutos y luego deseche el sobrenadante.
Resuspender las células en un mililitro de 1X PBS. Agregue 100 microlitros de solución de tinción TMRE a cada muestra y mezcle la suspensión con un suave pipeteo hacia atrás. Envuelva las muestras en papel de aluminio limpio para protegerlas de la luz e incube las células durante 20 minutos en un ambiente humidificado de CO2 a 37 grados centígrados.
Al final de la incubación, agregue una solución de trabajo 7-AAD a la muestra y mézclela. Para detectar caspasa-3 y 7 terminales activadas, comience diluyendo el péptido de unión al ADN unido a DEVE en DMSO a una proporción de 1: 8 con PBS estéril 1X para hacer que la solución de detección de caspasas funcione. Guarde la solución en hielo o agregue de dos a ocho grados centígrados, protegida de la luz.
Agregue dos microlitros de una solución madre de 7-AAD a 148 microlitros de 1X PBS para hacer que la solución de 7-AAD funcione. Guarde la solución en hielo o a dos a ocho grados centígrados, protegida de la luz. Centrifugar 50 microlitros de la suspensión celular durante cinco minutos a 300 veces G y desechar el sobrenadante.
Resuspender las células en 50 microlitros de 1X PBS, seguido de cinco microlitros de la solución de trabajo de detección de caspasas y mezclar bien. Afloje la tapa de los tubos e incube durante 30 minutos en un ambiente humidificado de CO2 a 37 grados centígrados, protegido de la luz. Agregue 150 microlitros de la solución de trabajo 7-AAD a cada muestra y mezcle.
Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz. Para detectar roturas de ADN de doble cadena y daño total del ADN, primero centrifugar 50 microlitros de la suspensión celular durante cinco minutos a 300 veces G y desechar el sobrenadante. Resuspender las células en 500 microlitros de 1X PBS y agregar 500 microlitros de un tampón de fijación a base de formaldehído y mezclar.
Incubar las muestras en hielo durante 10 minutos. Centrifugar durante cinco minutos a 300 veces G y desechar el sobrenadante. Resuspender las células en 90 microlitros de 1X PBS en un tubo de microcentrífuga.
Agregue 10 microlitros de la solución de anticuerpos al tubo de microcentrífuga. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad. Agregue 100 microlitros de 1X PBS y centrifugar durante cinco minutos a 300 veces G.Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 200 microlitros de 1X PBS.
Mezclar la muestra retropipeteando suavemente antes de cargar la muestra en el citómetro de flujo. Verifique el rendimiento analítico del citómetro de flujo ejecutando el kit de verificación del sistema del instrumento y no continúe con la ejecución de muestras hasta que se completen y pasen todas las comprobaciones. Primero, cargue una muestra de control negativo en el citómetro de flujo y seleccione Ejecutar, ajustar configuración, para que el instrumento comience a aspirar la muestra y proporcione una vista previa en tiempo real de los eventos detectados.
Con la vista previa en vivo, ajuste los umbrales de fluorescencia y tamaño de celda. Dibuje una puerta rectangular alrededor de la población de celdas, arrastre el marcador de umbral para excluir los desechos celulares y seleccione Siguiente, Establecer perfil de apoptosis para continuar. Toque y arrastre los marcadores de cuadrante para separar las poblaciones de celdas y trazar los eventos detectados en tiempo real.
Utilice estos gráficos para guiar al usuario final sobre la colocación adecuada de los marcadores de cuadrante. Seleccione Siguiente, Verificar configuración para continuar de modo que el instrumento muestre un resumen de la configuración. Después de revisar la configuración, seleccione Siguiente, Finalizar configuración para aplicar esta configuración a todas las muestras del experimento.
Mezclar la primera muestra retropipeteando suavemente y cargar la primera muestra en el citómetro de flujo. Seleccione Siguiente, asigne un nombre al ejemplo y seleccione Ejecutar para que el sistema comience a ejecutar el ejemplo. Si es necesario, realice ajustes finos de puertas o marcadores de cuadrante después de la adquisición.
Localice el experimento que necesita ajustes navegando por el explorador de archivos del sistema y abra el experimento. Toque la vista previa en miniatura de la trama para ampliarla. Para ajustar los marcadores de cuadrante, haga clic en la intersección de las líneas verticales y horizontales para mover los marcadores tal como están, y ajuste el ángulo de cualquiera de las líneas haciendo clic en la línea y arrastre el asa.
Para refinar la activación de la celda, haga clic en la pestaña Puerta y ajuste las dimensiones de la puerta. Ajuste los marcadores como desee y aplique esta configuración a todas las muestras del experimento seleccionando el icono de marca de verificación, marcando todas las muestras y seleccionando Aceptar. Ejecutar pruebas por triplicado y ejecutar un análisis de varianza con una prueba de Bonferroni post hoc para evaluar diferencias significativas entre las muestras y los controles.
El recuento de células y los resultados de viabilidad mostraron que el 95,2% de las células de la muestra estaban vivas y el 4,8% estaban muertas. Se encontró que la concentración celular era de 5,90 veces 105 células por mililitro. El ensayo de anexina V y muerte celular mostró un aumento significativo en las células apoptóticas en las células SiHa tratadas con 100 nanogramos por mililitro de actinomicina D, en comparación con los controles.
El ensayo de potencial transmembrana electroquímico mitocondrial demostró una disminución significativa en los perfiles de salud celular entre actinomicina-D, control medio y control de solvente, lo que sugirió que 100 nanogramos por mililitro de actinomicina D indujeron la despolarización mitocondrial en células SiHa. El ensayo de caspasa-3 y 7 demostró una activación significativa de caspasas terminales en células de SiHa tratadas con 100 nanogramos por mililitro de actinomicina D, en comparación con los controles. La actinomicina D indujo significativamente marcadores de daño en el ADN, ATM y H2A.
X en células SiHa, lo que sugirió un aumento significativo en el daño del ADN. Para mejorar la precisión, asegúrese de cosechar la población total de células. Además, cumpla con las concentraciones de células y los tiempos de tinción recomendados por el fabricante.
La protección de las muestras teñidas contra la luz evita el fotoblanqueo o los fluoróforos. El análisis bioquímico de la apoptosis por citometría de flujo debe ser apoyado por microscopía. Esto identificará las características morfológicas de la apoptosis clásica.
Las características incluyen condensación nuclear, mezcla de membrana celular, cuerpos apoptóticos y cariorrexis.
