Dieses Protokoll ermöglicht es den Forschern festzustellen, ob die Caspase-Aktivität in Verbindung mit dem Zelltod auftritt, und so verschiedene Arten des Zelltods zu identifizieren. Der Vorteil dieser Technik ist die Flexibilität, die Caspase-Aktivität an einem populationsbasierten Assay oder einer einzelnen Zelle zu bewerten. Stefanie Rufli, Doktorandin, und Jing Tong, Gastdoktorandin aus dem Labor von Wendy Wei-Lynn Wong, demonstrieren das Verfahren.
Nach der Differenzierung und Ernte der aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen oder BMDMs, wie im Manuskript beschrieben, säen Sie sie in einer Sechs-Well-Platte mit einer Dichte von 10 bis sechs Zellen pro Milliliter. Behandeln Sie die Zellen 16 Stunden lang mit SMAC-Mimetikum. Um das Zelllysat herzustellen, wird die Platte mit den behandelten Zellen auf das Eis übertragen und das Zellkulturmedium in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen gesammelt.
Zentrifuge bei 300 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Saugen Sie das Medium ab und legen Sie das Röhrchen auf Eis. Dann geben Sie einen Milliliter kaltes PBS in die Zellkulturplatte, um die Zellen zu waschen.
Nach dem Absaugen des gesamten PBS fügen Sie den Zellen 100 Mikroliter Trypsin hinzu. Sobald sich die Zellen von der Platte gelöst haben, sammeln Sie sie in der 1,5-Milliliter-Röhre. Nach dem Zentrifugieren der Zellsuspension wird der Überstand entfernt und das Pellet in 100 Mikroliter DISG-Lysepuffer resuspendiert.
Inkubieren Sie die Probe 20 Minuten lang auf Eis und zentrifugieren Sie dann das Lysat, um die unlösliche Fraktion zu pelletieren. Übertragen Sie 25 Mikroliter Lysat auf eine weiße 96-Well-Platte mit flachem Boden für den Caspase-3/7-Aktivitätstest und 10 Mikroliter auf eine transparente 96-Well-Platte mit flachem Boden für den Bicinchoninsäure- oder BCA-Assay. Für die Proteinquantifizierung bereiten Sie eine Reihe von Rinderserumalbumin- oder BSA-Konzentrationen als Standardprotein vor.
Sobald Standard-BSA zu der 96-Well-Platte mit flachem Boden gegeben wird, die die Proben enthält, mischen Sie die BCA-Reagenzien eins und zwei in einem Verhältnis von 50 zu eins und fügen Sie jeder Standardprobe 200 Mikroliter davon hinzu. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37 Grad Celsius wird die Extinktion bei 562 Nanometern auf einem fluorometrischen Gerät gemessen und die Proteinkonzentration mit der Standardkurve quantifiziert. Um einen populationsbasierten Assay durchzuführen, starten Sie das fluorometrische Gerät und heizen Sie das Gerät auf 30 Grad Celsius auf.
Stellen Sie die Anregungs- und Emissionswellenlänge auf 360 bzw. 465 Nanometer ein. Bereiten Sie dann eine Master-Reaktionsmischung auf Eis vor, wie im Manuskript beschrieben, um die Caspase-Aktivität zu bestimmen. Fügen Sie jeder Probe und jedem Standard 75 Mikroliter der Mischung hinzu, um ein Gesamtreaktionsvolumen von 100 Mikrolitern zu erhalten.
Messen Sie die Fluoreszenz sofort mit dem fluorometrischen Geräteaufbau und zeichnen Sie 40 Minuten lang jede Minute einzelne Messwerte auf, um die Reaktionskinetik zu bestimmen. Nach der Aussaat ernten Sie die adhärenten Zellen, wie zuvor gezeigt, in ein Fünf-Milliliter-Polystyrolröhrchen. Dann wird die Probe bei 300 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert und der Überstand entfernt.
Um die Färbemischung vorzubereiten, nehmen Sie einen Mikroliter des fluorogenen Substrats und verdünnen Sie es mit 150 Mikrolitern PBS. Pro Probe 50 Mikroliter Färbemischung zugeben, 30 Minuten im Dunkeln bei 37 Grad Celsius inkubieren und alle 15 Minuten mischen. In diesem populationsbasierten Assay zeigten die repräsentativen Daten des kinetischen Assays für die Caspase-3/7-Aktivität eine erhöhte Substratspaltung mit erhöhter SMAC-mimetischer Konzentration.
Der Anstieg bei 500 nanomolaren Konzentrationen war jedoch unbedeutend, basierend auf einer gewöhnlichen Einweg-ANOVA mit mehreren Vergleichen. Die Analyse der Caspase-3/7-Aktivität mittels Durchflusszytometrie zeigte eine Verschiebung der Fluoreszenz für die mit SMAC-Mimetika behandelten Zellen im Vergleich zu den unbehandelten Zellen, was sich auch in der dargestellten mittleren Fluoreszenzintensität zeigte und der Anstieg bei 500 nanomolaren Konzentrationen signifikant war. Das Verfahren sollte auf Eis durchgeführt werden.
Bei populationsbasierten Tests können Proben jedoch nicht unbegrenzt auf Eis belassen werden. Nach dem Lyseschritt sollten die Proben sofort weiterverarbeitet oder eingefroren werden. Die Abbildung der Caspase-Aktivität mittels Lebendzellmikroskopie wäre eine zusätzliche Methode, um kinetische Informationen auf Einzelzellebene zu gewinnen.
