Ce protocole permet aux chercheurs d’identifier si l’activité des caspases se produit en conjonction avec la mort cellulaire, identifiant ainsi différents modes de mort cellulaire. L’avantage de cette technique est la flexibilité d’évaluer l’activité des caspases lors d’un test basé sur la population ou d’une seule cellule. Stefanie Rufli, diplômée du doctorat, et Jing Tong, doctorant invité du laboratoire de Wendy Wei-Lynn Wong, feront la démonstration de la procédure.
Après avoir différencié et récolté les macrophages dérivés de la moelle osseuse ou BMDM comme décrit dans le manuscrit, ensemencez-les dans une plaque de six puits à la densité d’une fois 10 à la sixième cellule par millilitre. Traiter les cellules avec SMAC mimétique pendant 16 heures. Pour préparer le lysat cellulaire, transférez la plaque contenant les cellules traitées sur la glace et recueillez le milieu de culture cellulaire dans un tube de 1,5 millilitre.
Centrifuger à 300 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Aspirer le milieu et mettre le tube sur de la glace. Ajoutez ensuite un millilitre de PBS froid à la plaque de culture cellulaire pour laver les cellules.
Après avoir aspiré tout le PBS, ajoutez 100 microlitres de trypsine aux cellules. Une fois les cellules détachées de la plaque, rassemblez-les dans le tube de 1,5 millilitre. Après avoir centrifugé la suspension cellulaire, retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans un tampon de lyse DISC de 100 microlitres.
Incuber l’échantillon sur de la glace pendant 20 minutes, puis centrifuger le lysat pour enrober la fraction insoluble. Transférer 25 microlitres de lysat dans une plaque blanche à fond plat de 96 puits pour le test d’activité de la caspase-3/7 et 10 microlitres dans une plaque transparente à fond plat de 96 puits pour le test de l’acide bicinchoninique ou BCA. Pour la quantification des protéines, préparer une gamme de concentrations d’albumine sérique bovine ou de BSA comme protéine standard.
Une fois que le BSA standard est ajouté à la plaque à fond plat de 96 puits contenant les échantillons, mélanger les réactifs BCA un et deux dans un rapport de 50 pour un et ajouter 200 microlitres à chaque échantillon dans l’étalon. Après une incubation à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, mesurer l’absorbance à 562 nanomètres sur un instrument fluorométrique et quantifier la concentration en protéines à l’aide de la courbe standard. Pour effectuer un test basé sur la population, démarrez l’instrument fluorométrique et chauffez la machine à 30 degrés Celsius.
Réglez la longueur d’onde d’excitation et d’émission à 360 et 465 nanomètres respectivement. Ensuite, préparez un mélange de réaction maître sur la glace comme décrit dans le manuscrit pour déterminer l’activité de la caspase. Ajouter 75 microlitres du mélange à chaque échantillon et étalon pour obtenir un volume de réaction total de 100 microlitres.
Mesurez immédiatement la fluorescence à l’aide de la configuration de l’instrument fluorométrique et enregistrez les lectures individuelles toutes les minutes pendant 40 minutes pour déterminer la cinétique de réaction. Après l’ensemencement, récoltez les cellules adhérentes comme démontré précédemment dans un tube en polystyrène de cinq millilitres. Ensuite, centrifuger l’échantillon à 300 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et retirer le surnageant.
Pour préparer le mélange de coloration, prenez un microlitre de substrat fluorogénique et diluez-le avec 150 microlitres de PBS. Ajouter 50 microlitres de mélange de coloration par échantillon, incuber dans l’obscurité à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes et mélanger toutes les 15 minutes. Dans ce test basé sur la population, les données représentatives du test cinétique pour l’activité de la caspase-3/7 ont montré une augmentation du clivage du substrat avec une concentration mimétique SMAC accrue.
Cependant, l’augmentation à une concentration de 500 nanomolaires était insignifiante sur la base d’une ANOVA unidirectionnelle ordinaire avec de multiples comparaisons. L’analyse de l’activité de la caspase-3/7 à l’aide de la cytométrie en flux a indiqué un changement de fluorescence pour les cellules traitées avec des mimétiques SMAC par rapport aux cellules non traitées, ce qui était également évident dans l’intensité médiane de fluorescence tracée et l’augmentation à une concentration de 500 nanomolaires était significative. La procédure doit être effectuée sur la glace.
Cependant, dans le cas d’un essai basé sur la population, les échantillons ne peuvent pas être laissés sur la glace indéfiniment. Après l’étape de lyse, les échantillons doivent être traités ou congelés immédiatement. L’imagerie de l’activité des caspases à l’aide de la microscopie sur cellules vivantes serait une méthode supplémentaire pour obtenir des informations cinétiques au niveau d’une seule cellule.
