Este método ayuda a comprender las diferencias fenotípicas de las células RP en toda la retina humana. La técnica de disección que ha desarrollado Davide Ortolan es altamente reproducible para generar un desprendimiento entre la RP y la retina. Y el software REShAPE es realmente apreciable en el análisis de imágenes grandes de montajes planos RP.
El método que Davide ha desarrollado se puede utilizar para estudiar las diferencias regionales en el fenotipo RP de pacientes con diferentes tipos de enfermedades degenerativas de la retina. Para comenzar, corte el tubo cónico de 50 mililitros ligeramente por debajo de la marca de 5 mililitros. Con pegamento caliente, fije la punta del tubo al fondo del bote de pesaje.
Luego mezcle los dos componentes del kit de elastómero de silicona en una proporción de 10 a 1 evitando atrapar el aire. Vierta la mezcla en el bote de pesaje que contiene esta pieza esférica del tubo de fondo redondo. Curar la silicona a temperatura ambiente durante la noche.
Retire el bote de pesaje y el tubo de fondo redondo del molde de silicona curado. Primero, llene una jeringa de 1 mililitro con 1700 milimoles de solución de D-manitol y conéctela a una aguja de calibre 21. Inserte la aguja a través de la pars plana para evitar perforar la cámara anterior del ojo e inyecte 400 microlitros de la solución en el vítreo.
Deje el ojo a temperatura ambiente durante 45 minutos. Con un par de tijeras finas y fórceps, abra la cámara anterior al nivel de la pars plana. Llene la cámara posterior del ojo con DPBS que contenga calcio y magnesio.
Bajo el microscopio estéreo, localice la mácula visualizada como una mancha amarilla en la retina. Corte el ojo en cuadrantes, a saber, nasal, temporal, superior e inferior, mientras se asegura de preservar la región macular. Retire las agujas si están en el camino.
Transfiera la mariposa a la cámara posterior del ojo en una placa de Petri de 100 milímetros que contenga DPBS con calcio y magnesio. Antes de extraer la retina, marque el pétalo que contiene la mácula haciendo un corte en forma de V en el margen ciliar. Levante y corte todo el vítreo que se encuentra en la retina.
Cortar la retina de los márgenes ciliares en todos los pétalos asegurándose de no rayar el EPR. Coloque el tejido en 4% PFA e incube durante una hora. Lavar tres veces con DPBS que contenga calcio y magnesio.
Transfiera el tejido a un recipiente lleno del mismo tampón y guárdelo a 4 grados centígrados. A continuación, transfiera la muestra a una placa de Petri de 100 milímetros que contenga DPBS con calcio y magnesio. Perfore la cabeza del nervio óptico con un punzón de biopsia de 1,5 milímetros.
Recoge la retina y guárdala en el mismo tampón a 4 grados centígrados. Para eliminar la esclerótica de la coroides del EPR, levante suavemente la capa coroidea del EPR de la periferia. Luego, con un par de tijeras Vannas Spring, corte los vasos coroideos y el tejido conectivo que se encuentran entre la esclerótica y el EPR.
Después de la separación completa de la esclerótica, recoger la capa coroidea del EPR. Transfiera el tejido a un recipiente lleno de DPBS que contenga calcio y magnesio, y guárdelo a 4 grados centígrados. Transfiera la coroides del EPR a un pocillo de una placa de seis pocillos.
Bloquear y permeabilizar la muestra durante una hora a temperatura ambiente. Incubar la muestra durante una hora a temperatura ambiente con faloidina conjugada con 647 fluoróforos en una dilución de 1 a 250 en el tampón de permeabilización. Lavar tres veces en DPBS que contengan calcio y magnesio.
Transfiera la muestra de coroides del EPR a un portaobjetos de vidrio de 50 x 75 milímetros y aplátelo. Corta cada pétalo en dos para que la muestra sea más plana. Dibuje un contorno del soporte plano con un bolígrafo hidrófobo.
Para apagar la autofluorescencia de lipofuscina, agregue 500 microlitros de la solución de autofluorescencia y cúbrala a temperatura ambiente durante dos minutos. Lavar bien en DPBS que contengan calcio y magnesio. Retire el DPBS y agregue el medio de montaje.
Coloque un vidrio de cubierta en el soporte plano y selle con esmalte de uñas. Abra el software. En la pestaña directorios, seleccione las carpetas de entrada y salida.
En el directorio de salida, deje que el software cambie automáticamente la ruta al directorio o proceso de entrada. Como alternativa, cambie el directorio de salida manualmente. Para generar mapas de calor, seleccione todos en el menú desplegable en la pestaña crear imágenes en color.
Marque la casilla no en la función de uso manual de límites para permitir que el software utilice los valores mínimos y máximos detectados en cada imagen. Marque la casilla sí para ajustar manualmente el rango de valores para cada mapa de calor métrico de forma. Luego haga clic en el botón establecer límites e inserte valores en los cuadros de texto para elegir rangos para los parámetros individuales.
Después de cambiar los valores de interés, haga clic en guardar. Haga clic en valores predeterminados bajos para restablecer todos los límites. Para seleccionar un umbral de tamaño de celda en tamaño de celda inferior, inserte el tamaño de la celda más pequeña que se incluirá en el análisis.
En tamaño de celda superior, inserte el tamaño de la celda más grande que se va a incluir. En convertir píxeles en unidades reales, marque no para ejecutar el análisis en unidades de píxeles, marque sí para ejecutar el análisis en micrómetros. En longitud de los píxeles de la barra de escala, introduzca el valor de píxel en el cuadro de texto.
En longitud de micras de barra de escala, ingrese la distancia correspondiente en micrómetros. Para iniciar el análisis, presione ir para ello. Este protocolo da como resultado una imagen de un solo plano de un montaje plano donde la ubicación de la celda se identifica mediante la segmentación generada por REShAPE de los bordes de celda RPE.
Además, se miden 30 métricas de forma, incluido el área de celda de las celdas RPE individuales, para cada celda RPE identificada correctamente. Las baldosas negras resultantes de piezas residuales de retina u otros objetos brillantes se pueden eliminar eligiendo una de las opciones de filtrado disponibles en el menú desplegable del filtro RT. El uso de imágenes RBG para el análisis de remodelación producirá imágenes binarias completamente negras.
Si esto ocurre, la conversión de las imágenes RGB a escala de grises producirá imágenes binarias correctamente segmentadas. Si la tinción no es óptima o si la muestra está dañada por un rasguño, entonces grandes grupos de células pueden identificarse como una sola célula muy grande. En este caso, los objetos grandes se pueden excluir del análisis cambiando el umbral de tamaño de celda.
Para obtener un tejido plano, la RP y la coroides deben separarse de la esclerótica, incluso si estos pasos pueden llevar mucho tiempo. Después de la generación del montaje plano RP, es posible teñir marcadores RPE adicionales para que pueda estudiar diferentes regiones de la monocapa RP. Usando este método, hemos descubierto cinco poblaciones diferentes de RP que son diferencialmente sensibles a diferentes enfermedades degenerativas de la retina.
