Este protocolo para el que todas las condiciones experimentales se han optimizado cuidadosamente se puede utilizar para facilitar una conjugación química exitosa y eficiente del anticuerpo DEC-205 al antígeno OVA. Las principales ventajas de esta técnica son que permite una selección flexible del antígeno proteico y del anticuerpo, y que no se basa en la fusión genética de estos componentes. También hemos utilizado este protocolo para generar conjugados de proteínas del virus de la hepatitis C y anti-DEC-205 para la focalización de CC in vivo.
Esto también podría ser valioso para los enfoques de vacunación antitumoral. Para comenzar la producción anti-DEC-205, resusped un volumen de un mililitro de uno a cinco millones de células NLDC 145 crioconservadas descongeladas en nueve mililitros de medio ISF-1 de 37 grados Celsius suplementado con penicilina al 1% y estreptomicina, y sembrar las células en un matraz de cultivo celular de 25 centímetros cuadrados para incubación a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 24 a 48 horas. Cuando las células alcancen el 70% de confluencia, transfiera toda la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros y recoja las células por centrifugación.
Resuspender el pellet en 12 mililitros de medio ISF-1 de 37 grados completo y volver a colocar las células en un matraz de 75 centímetros cuadrados. Después de 48 a 72 horas de cultivo, divida el cultivo confluente del 70% entre cada uno de los dos nuevos matraces de 75 centímetros cuadrados y agregue seis mililitros de medio ISF-1 completo fresco a cada matraz. Cuando los cultivos alcancen el 70% de confluencia, use una pipeta de 10 mililitros para enjuagar los fondos de matraz de cultivo celular y las superficies de cultivo con la suspensión celular para recolectar todas las células y transferir 10 mililitros de cada suspensión de células NLDC 145 expandida en botellas de rodillos PETG individuales.
Luego agregue 140 mililitros de medio ISF-1 completo a cada cultivo de botella de rodillo y cultive las botellas de rodillos a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono y 25 rondas por minuto durante tres días. Para la purificación de anticuerpos del sobrenadante NLDC 145, coloque el extremo de un tubo de silicio en el vaso de precipitados lleno de sobrenadante y permita que 800 mililitros de sobrenadante pasen gota a gota a través de una columna de sefalrosa de proteína G. Para la elución, agregue 100 microlitros de 1.5 molares Tris-HCL en cada uno de los veinte tubos de 1.5 mililitros y retire el tapón de goma de la columna.
Transfiera un mililitro de glicina molar 0,1 a la cámara superior de la columna y recoja el anticuerpo que contiene el eluyente en uno de los tubos preparados de 1,5 mililitros y repita para cada tubo. Cuando se haya recolectado todo el anticuerpo y se hayan agrupado las eluciones que contienen anticuerpos, cierre la parte inferior de un tubo de diálisis de 20 centímetros de longitud con un cierre de tubo de diálisis apropiado y pipetee cuidadosamente la elución de anticuerpos en el tubo. Cierre la parte superior del tubo de diálisis con una segunda abrazadera y fije la abrazadera superior del tubo de diálisis a un soporte flotante.
Agregue una barra de agitación magnética a un vaso de precipitados de PBS y coloque el vaso de precipitados en un agitador magnético. Después de la diálisis nocturna a cuatro grados Centígrados, abra una abrazadera para permitir la carga del dializado completo en un concentrador centrífugo con un corte de peso molecular de 10 kiloDalton y centrifugue el concentrador durante 30 minutos a 693 veces G y cuatro grados Celsius. Al final del centrifugado, cargue el concentrador centrífugo con 10 mililitros de PBS para una segunda centrifugación hasta obtener un volumen final de solución de anticuerpos de uno a 1,5 mililitros.
Para conjugar OVA con el anticuerpo anti-DEC-205, agregue 200 microlitros de PBS suplementados con 500 microgramos de proteína OVA, 240 microlitros de una solución de TCEP-HCL recién preparada y 560 microlitros de agua ultrapura estéril a un tubo de 1.5 mililitros para una incubación de 1.5 horas a temperatura ambiente. Al mismo tiempo, agregue 2.5 miligramos de anti-DEC-205 en 900 microlitros de PBS y 100 microlitros de sulfo-SMCC recién preparado a un segundo tubo de 1.5 mililitros para una incubación de 30 minutos a 37 grados Celsius a 550 revoluciones por minuto en un bloque de calentamiento. Al final de las incubaciones, coloque las columnas de desalinización con tapas aflojadas y fondos retorcidos en tubos cónicos individuales de 15 mililitros, y centrifute las columnas para eliminar el líquido.
Después de la centrifugación, coloque las columnas en tubos nuevos con las tapas retiradas y cargue lentamente las soluciones de anticuerpos sulfo-SMCC y OVA TCEP-HCL en el centro del lecho de resina compacto de una columna por solución. Después de centrifugar, deseche las columnas e inmediatamente mezcle las soluciones de anticuerpos y OVA con pipeteo suave. Cargue la solución anti-DEC-205/OVA en un concentrador centrífugo de proteínas y llene el concentrador con PBS a un volumen de 15 mililitros.
Centrifugue el concentrador durante cinco minutos a 2.000 veces G y temperatura ambiente y llene el concentrador con 10 mililitros adicionales de PBS. Después de centrifugar la concentración durante al menos ocho minutos en las mismas condiciones de centrifugación, recoja suavemente la muestra concentrada de la cámara superior. Para verificar el éxito de la conjugación mediante el análisis de Western blot, cargue una alícuota de cada muestra en un estándar de proteína en un gel SDS y ejecute el gel de acuerdo con los protocolos de análisis estándar SDS-PAGE.
Después de la eliminación en gel, tiñe las membranas con anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano picante para detectar anti-DEC-205 u OVA de acuerdo con los protocolos estándar. Las membranas pueden ser analizadas para la presencia de la proteína respectiva en cada muestra. Para verificar el éxito de la conjugación por ELISA, cubra una placa ELISA apropiada de 96 pocillos con 100 microlitros del anticuerpo anti-OVA por pocillo y diluya en serie anti-DEC-205/OVA en una proporción de uno a dos y bloquee el tampón para obtener diluciones de seis microgramos por mililitro a 93,8 nanogramos por mililitro.
Agregue 100 microlitros de cada dilución a los pocillos apropiados de la placa recubierta de anticuerpos durante una incubación de una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación, agregue 100 microlitros de anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante contra el anti-DEC-205 / OVA conjugado a la placa durante una incubación de una hora a temperatura ambiente, luego agregue 50 microlitros de sustrato de peroxidasa de rábano picante a cada pozo para permitir el análisis de la reacción de color por espectrofotometría. El análisis paralelo de Western blot se puede utilizar para detectar tanto OVA conjugado como anti-DEC-205 conjugado.
La tinción para OVA permitiría la detección de exceso de OVA libre si está presente, y la tinción para anti-DEC-205 verifica el éxito de la conjugación a través de un aumento en el peso molecular entre el anti-DEC-205 desnudo y el conjugado. ELISA también se puede utilizar para evaluar el éxito de la conjugación con una asociación positiva entre la señal detectada y la cantidad analizada de proteína que indica la generación exitosa de conjugante anti-DEC-205/OVA. La citometría de flujo y el análisis de inmunofluorescencia muestran claramente que el núcleo anti-DEC-205 se une de manera eficiente a las células CD11c positivas derivadas de la médula ósea.
La vacunación con anti-DEC-205/OVA junto con adyuvante induce un aumento en los títulos de IgG específicos de OVA en los receptores de ratón en comparación con la vacunación con OVA y adyuvante solo. Además, anti-DEC-205/OVA induce eficientemente respuestas de células T CD4 y CD8 positivas sobreespecíficas con las respuestas de células T CD8 positivas inducidas por ANTI-DEC-205/OVA que exceden significativamente las inducidas por OVA solo. Para una conjugación exitosa del antígeno OVA al anticuerpo anti-DEC-205, es importante preparar los materiales como se ha demostrado y realizar los pasos de conjugación en condiciones consistentes.
Después de la conjugación exitosa del antígeno y el anticuerpo, son posibles numerosos enfoques posteriores, incluido el análisis de unión y la inducción de inmunidad patógena o relacionada con tumores in vivo.
