Este protocolo describe un método para medir el control mecánico de la relajación o la dependencia de la tensión de la relajación muscular en la trabécula cardíaca. La principal ventaja de esta técnica es que se centra en la relajación cardíaca. Dada la falta de opciones de tratamiento para las enfermedades diastólicas, esta técnica podría usarse para identificar nuevos índices y objetivos farmacológicos relacionados con la relajación cardíaca.
Este método se mostrará con un corazón de roedor, pero se puede usar en cualquier músculo intacto. Demostrando este procedimiento seremos yo y Anita Abbo, una asistente de investigación de pregrado en mi laboratorio. Para comenzar, retire el corazón del modelo de animal pequeño disecado grueso de la cánula y colóquelo en un plato de pesaje recubierto de elastómero de silicona para prepararse para el aislamiento trabecular.
Luego coloque e ilumine el corazón bajo un microscopio estéreo. Después de localizar el tracto de salida del ventrículo derecho, fije la aurícula izquierda y el ápice ventricular al elastómero de silicona en el plato. Usando tijeras Vannas largas, corte desde el tracto de salida del ventrículo derecho hasta el ápice a lo largo del tabique.
Luego, corte desde el tracto de salida del ventrículo derecho hasta la aurícula derecha cerca de la aorta, y luego corte a través de la aurícula derecha. Con fórceps, abra con cuidado la pared libre del ventrículo derecho del tracto de salida sin estirar el tejido. Las hebras delgadas blancas de tejido conectivo, si se encuentran, se pueden cortar, pero no las hebras de tejido rosado más grandes, ya que pueden ser trabéculas.
Fije la pared libre del triángulo del ventrículo derecho al plato para exponer el ventrículo derecho. Usando una pipeta delgada de vidrio fundido de extremo romo, busque trabéculas independientes en el endocardio expuesto sin aplicar presión. Evite los músculos papilares triangulares y seleccione trabéculas con lados paralelos, que a menudo se encuentran cerca de la base de la pared libre del ventrículo derecho y a lo largo del tabique.
Disecciona la trabécula con pequeñas tijeras Vannas, dejando un pedazo de tejido de un milímetro cúbico en cada extremo de la trabécula para permitir la fijación. A continuación, corte aproximadamente dos pulgadas del extremo de una pipeta de transferencia de siete mililitros, extraiga lentamente la trabécula en la pipeta y transfiérala a un nuevo plato de pesaje, que contenga una solución de perfusión al 50% y una solución de Tyrode modificada al 50%. Permita que el músculo se equilibre al aumento de calcio extracelular dentro de la solución mezclada durante varios minutos.
Apague la bomba que suministra superfusión o succión a la cámara experimental. Utilizando la pipeta de transferencia de gran calibre, mueva la trabécula a la cámara experimental llena con la solución de Tyrode. Fije una pieza cúbica de tejido en el extremo de la trabécula a un gancho en el transductor de fuerza, luego fije el segundo cubo al motor.
Reinicie la superfusión y comience a marcar el ritmo del músculo para determinar el voltaje umbral. Avance a un 20% por encima del voltaje umbral durante aproximadamente una hora. Al final de este período de equilibrio, estire lentamente el músculo usando el micrómetro conectado al motor, hasta que se logre una generación óptima de estrés desarrollado observando la tensión desarrollada.
Deje de aumentar la longitud muscular cuando la tensión diastólica pasiva aumenta más rápido que la tensión máxima, lo que indica que se ha superado la longitud óptima. Apague la iluminación del microscopio transmitido e ilumine la trabécula con un iluminador de cuello de cisne en un ángulo pronunciado. Usando una cámara previamente calibrada conectada a través de la óptica del microscopio, capture una imagen de la trabécula durante la diástole en la carpeta experimental.
Promedia las medidas de diámetro y convierte el diámetro y la longitud de píxeles a milímetros utilizando una calibración obtenida previamente. Calcular el área de la sección transversal y la longitud del músculo en micrómetros. En el software de adquisición de datos, adquiera datos de carga sujeta definiendo la poscarga en el archivo dap, e itere valores de ganancia proporcional y parámetros de integración guardando el archivo en el editor de texto, luego presione Ejecutar experimento" en la interfaz.
Controle el extremo de la abrazadera de carga cambiando el modo. Repita la adquisición mientras cambia el extremo de la abrazadera de carga de cero a completo, volviendo a alargar hasta la longitud inicial. Para aumentar la longitud, aumente gradualmente el umbral para terminar la pinza de carga desde cero hasta que el músculo casi se vuelva a alargar a su longitud original.
Si lo desea, modifique la poscarga y repita la adquisición inmediatamente. Si lo desea, modifique la precarga estirando o acortando el músculo, o trate el músculo agregando compuestos a la solución de Tyrode, pero espere un mínimo de 20 minutos para asegurarse de que la respuesta de fuerza lenta se haya estabilizado y para que el compuesto penetre completamente en el músculo. Una vez completada la adquisición de datos, retire la trabécula y limpie el sistema experimental.
Cuantifique la relajación asegurándose de que el programa de análisis de datos analice el latido de sujeción y que el programa adquiera correctamente el inicio de la abrazadera de carga. Después de cuantificar todos los rastros de una condición dada, trace la relación entre la tasa de relajación y la velocidad de deformación, limitando los datos máximos a una tasa de deformación fisiológica de menos de uno por segundo. Excluya los datos a bajas tasas de deformación, ya que la fase de relajación puede no reflejar el decaimiento exponencial.
Obtenga la pendiente de la línea entre la tasa de relajación y la velocidad de deformación, y registre la pendiente como el índice de control mecánico de la relajación. Aquí se muestra una sola trabécula cardíaca iluminada con una luz LED de cuello de cisne en un ángulo pronunciado de 75 grados desde el eje de la lente del microscopio. Las curvas de tiempo de estrés y tiempo de deformación para la misma trabécula mostraron una contracción isométrica y tres contracciones de pinza de carga a tasas de deformación sistólicas y crecientes.
La velocidad de deformación se calcula a partir de la derivada de la deformación justo antes de la relajación isométrica. Los datos se representan en un gráfico de velocidad de relajación versus velocidad de deformación, donde la pendiente de la línea proporciona el control mecánico de relajación, o índice MCR. El componente más difícil en este protocolo es un aislamiento cuidadoso de la trabécula cardíaca.
Este protocolo se puede combinar con otras mediciones del músculo, incluyendo calcio intracelular, contractilidad y longitud del sarcómero. Además, este método se está utilizando para identificar mecanismos moleculares y comprender mejor la fisiopatología de la relajación cardíaca alterada.
