Este método nos permitirá evaluar el papel de la cavidad pericárdica que rodea el corazón y su contenido en la reparación cardíaca tras un infarto de miocardio. En comparación con los métodos convencionales de ligadura coronaria para modelar el infarto de miocardio, nuestro método mantiene intacta la cavidad pericárdica, lo que permite la determinación del contenido y rastrea sus funciones después de una lesión isquémica cardíaca. Comprender la contribución de la cavidad pericárdica y la respuesta a la lesión del corazón proporcionará información importante sobre las estrategias terapéuticas que se dirigen al pericardio para mejorar la curación del corazón.
Para comenzar con la anestesia posterior, sujete las patas del ratón y colóquelo en la mesa quirúrgica. Después de preparar al ratón para la cirugía como se describe en el manuscrito, ventile el ratón con 2% de isoflurano y 100% de oxígeno como gas portador utilizando un ventilador comercial. Luego establezca una velocidad de 110 respiraciones por minuto, un volumen corriente de 250 microlitros y una presión espiratoria final positiva de cuatro milímetros de mercurio.
Haga rodar el ratón 30% sobre su lado derecho para colocar el lado izquierdo del pecho para la cirugía. Luego haga una incisión lateral de dos a tres centímetros en la piel del pecho para visualizar los músculos pectorales en el lado izquierdo. Haga una incisión de un centímetro desde la línea media hacia afuera para cortar el pectoral mayor y menor.
Evite el sangrado excesivo durante la cauterización de los vasos sangrantes. Visualiza los músculos intercostales entre la tercera y cuarta costilla. Haga una incisión de dos centímetros en el músculo intercostal izquierdo para introducir aire en la cavidad torácica y permitir que el corazón y los pulmones se desprendan de la incisión.
Para incidir el intercostal sin sangrado, detenga temporalmente el ventilador y expanda la abertura con un dispositivo de cauterio. Usando retractores, retraiga las costillas para exponer el corazón. Luego observe el pericardio y el corazón subyacente bajo un microscopio estéreo.
Coloque suavemente los fórceps en la superficie del pericardio para reducir el pericardio y el movimiento subyacente del corazón. Visualmente hito de la arteria coronaria LAD mediante el seguimiento de su aparición debajo del apéndice izquierdo. Usando el controlador de microagujas, guíe una sutura apropiada a través del pericardio debajo del LAD.
Observe la sutura que emerge en el otro lado de la LAD y el pericardio. Representando el modelo de ligadura permanente, ate la sutura para restringir el flujo sanguíneo a través de la arteria coronaria, haciendo visible el escaldado de la porción anterior del ventrículo izquierdo. Luego recorte el exceso de sutura con la ayuda de tijeras.
Proporcionar inyecciones de mantenimiento de analgésico por vía subcutánea cada 12 horas durante 72 horas después de la cirugía. Después de reducir el isoflurano al 1%, apague el isoflurano mientras mantiene la ventilación con oxígeno. Una vez que el animal muestre signos de respiración, retire el tubo traqueal de calibre 23 de la boca y coloque al ratón en una jaula de recuperación para controlar la reanudación de la respiración.
Permita que el ratón se recupere en la jaula con una parte de la jaula colocada en una almohadilla de calentamiento para proporcionar una fuente de calor externa. Controle el estado de salud del ratón diariamente durante siete días evaluando las incisiones y las molestias de los animales. Si es necesario, administre antibióticos para una recuperación exitosa después de la cirugía invasiva.
Después de mantener al ratón bajo anestesia general con oxígeno, coloque el ratón en posición supina en una plataforma de escenario calentada y conecte las patas a los cables del ECG. Luego roza el pecho. Adquiera imágenes de ECG utilizando sonda de transductor y gel de contacto y analícelas con el software apropiado.
Después de la evaluación no invasiva del ECG, apague el isoflurano y devuelva el ratón a la jaula. Fijar el corazón en formalina al 10% durante al menos 24 horas. Corte la muestra con una cuchilla de afeitar recta a través del ventrículo derecho, el tabique interventricular y el ventrículo izquierdo, asegurándose de que la incisión pase por el centro de la zona del infarto.
Y luego la parafina incrusta las muestras de tejido. Las secciones cortadas se colocan en un casete de montaje para una mayor incrustación de parafina y la posterior sección en secciones de cinco micrómetros de espesor. Después de la colocación de secciones de tejido en portaobjetos, desparafinar usando tolueno y lavados con alcohol graduado con agua desionizada.
Luego rehidratar. A continuación, tiñe la sección con 0,1% de rojo sirio en ácido pícrico durante dos horas a temperatura ambiente. Lave la sección con ácido acético al 0,5% durante tres minutos, seguido de enjuague con etanol al 70% durante un minuto.
Deshidratar la sección utilizando el orden inverso de los lavados con concentraciones de etanol crecientes y graduadas antes de montarlas para una evaluación microscópica. La inducción exitosa del infarto de miocardio con la ligadura coronaria modificada se evaluó mediante el examen de los parámetros funcionales del corazón y las características estructurales. Para la función, la disminución de la fracción de eyección del ventrículo izquierdo se evaluó mediante ecocardiografía dentro de las tres a cuatro semanas posteriores al infarto de miocardio.
La tinción histológica demostró que los cambios funcionales se acompañaron de fibrosis significativa de la pared del ventrículo izquierdo, que se confirmaron aún más mediante la cuantificación de la fibrosis teñida de rojo picrosirius en las secciones transversales del corazón a las cuatro semanas después del infarto con los modelos de ligadura coronaria pericárdica interrumpida o intacta. La combinación del método de etiquetado de perlas fluorescentes con el análisis de citometría de flujo proporcionó un enfoque para rastrear los macrófagos pericárdicos positivos de Gata6 residentes. Es importante destacar que se detectó poco o ningún etiquetado en el corazón o la sangre.
Después del infarto de miocardio, la reubicación de las células se puede rastrear mediante citometría de flujo e imágenes. Se muestra la cuantificación de las células mieloides pericárdicas marcadas con perlas fluorescentes con o sin infarto de miocardio. Se necesita cuidado para evitar interrumpir o desgarrar inadvertidamente el pericardio delgado durante el procedimiento.
Este método se puede combinar con el rastreo del linaje celular o el bloqueo efector, lo que permitirá rastrear y determinar el impacto del componente pericárdico en la respuesta de curación en el corazón infartado. Hemos identificado que la cavidad pericárdica protege el corazón después de una lesión, que está parcialmente mediada por macrófagos pericárdicos residentes. Este enfoque abre una nueva área de investigación para la enfermedad cardiovascular.
