El protocolo presentado es un método altamente flexible para la manipulación del genoma en el oviducto del ratón. Permite la formación de células mutadas esporádicamente rodeadas de células no editadas dentro de un ambiente inmunocompetente. Esto es ventajoso para estudiar la iniciación del cáncer.
La principal ventaja de esta técnica es su alta adaptabilidad para dirigirse a un órgano, área, región o tipo de célula de interés con conjuntos fácilmente intercambiables de combinaciones de mutaciones, todo sin la necesidad absoluta de una línea de ratón. Este método se puede adaptar fácilmente para su uso en órganos con la luz, así como el parénquima de órganos. Para comenzar, tire de un tubo capilar de vidrio en un punto afilado con un extractor de micropipetas.
Usando un par de pinzas cónicas de punta ultrafina, corte el extremo puntiagudo del tubo capilar tirado bajo un microscopio de disección para crear una abertura. Asegúrese de que la abertura no sea demasiado grande, ya que dañará el oviducto y evitará la inyección lenta. Luego, coloque el equipo de cirugía estéril, el microscopio, el micromanipulador y el electroporador en un banco limpio y estéril o dentro del gabinete de bioseguridad.
Caliente la almohadilla térmica en un disco y colóquela debajo de una jaula limpia y totalmente equipada. Vierta 1X PBS estéril en una placa de Petri. Con un par de tijeras limpias, corte el papel absorbente en cuadrados de uno por un centímetro.
Déjalos caer en PBS para remojarlos. A continuación, conecte la aguja capilar tirada al micromanipulador de montaje de abrazadera, estabilizado por un soporte magnético. Pipetear dos microlitros de la solución inyectable sobre una placa de Petri estéril.
Mientras observa bajo el microscopio, tome lentamente uno o dos microlitros de la solución inyectable en la aguja de microinyección usando la jeringa a presión de aire conectada al micromanipulador. Evite tomar burbujas en la aguja. Después de anestesiar a una hembra de ratón de seis a ocho semanas de edad y administrar carprofeno por vía subcutánea, coloque el ratón sobre el papel absorbente calentado con el lado dorsal hacia arriba.
Aplique lubricante ocular en cada ojo para evitar que se seque durante la cirugía. Después de confirmar el paro anestésico pellizcando el dedo del pie con un par de fórceps, retire el pelaje dorsal alrededor del sitio de la posible incisión y limpie la piel desnuda con antiséptico. Use un par de pinzas rectas y romas para pellizcar la piel desnuda y crear una incisión de un centímetro de largo a lo largo de la línea media del cuerpo con un par de tijeras estériles.
Pellizque y sostenga un lado del sitio del corte con un par de pinzas Adson estériles. Luego, usando un par de pinzas estériles, curvas y dentadas, separe suavemente la piel de la pared del cuerpo, comenzando en la incisión de la línea media y moviéndose lateralmente. Después de ubicar la almohadilla de grasa debajo del riñón, use un par de pinzas estériles, rectas y romas para pellizcar la pared del cuerpo directamente sobre la almohadilla de grasa.
Cree una pequeña incisión en la pared del cuerpo con un par de tijeras de disección estériles, afiladas y puntiagudas, teniendo cuidado de evitar los vasos sanguíneos. Mientras sigue pellizcando la pared del cuerpo con fórceps rectos y romos, inserte un par de pinzas estériles, romas y curvas en la incisión y amplíe la incisión creada en la pared del cuerpo. Agarre la almohadilla de grasa visible con los fórceps romos y curvos y sáquela del orificio para exponer el ovario, el oviducto y el útero.
Mantenga la vía reproductiva expuesta sujetando la almohadilla de grasa con una pinza de bulldog estéril. Coloque cuidadosamente el ratón anestesiado con la vía reproductiva expuesta en el escenario de un microscopio de disección. Ajuste el micromanipulador de tal manera que la aguja de inyección con la solución se observe bajo el microscopio.
Luego manipule el microscopio para observar fácilmente el ovario, el oviducto y el útero. Usando un par de pinzas estériles, cónicas y de punta ultrafina, sostenga la región del oviducto que se inyectará. La región debe alinearse con la dirección de la aguja de microinyección.
Ajuste el micromanipulador para perforar el oviducto con la aguja de microinyección, mientras alimenta simultáneamente el oviducto en la aguja utilizando las pinzas cónicas de punta ultrafina. Mueva suavemente la aguja de microinyección para confirmar que se ha insertado en el oviducto. Inyecte lentamente un microlitro de la solución inyectable y azul de tripano filtrado al 5% en el oviducto, mientras observa el movimiento de la solución azul y la expansión de la luz del oviducto.
Evite introducir burbujas en el lumen. Después de la inyección, retire la aguja del oviducto y cubra el área a atacar con un trozo de papel absorbente previamente empapado en PBS. Agarre el papel previamente empapado y el área a la que se dirigirá con un par de pinzas de electrodos y retírese del cuerpo.
Electroporar la región objetivo usando tres pulsos unipolares a 30 voltios durante 50 milisegundos con intervalos de un segundo. Después de la electroporación, retire el papel absorbente y vuelva a colocar el ratón sobre la almohadilla térmica. Desenganche la abrazadera de bulldog y empuje con cuidado la pista reproductiva expuesta debajo de la pared del cuerpo.
Después de que ambos oviductos hayan sido electroporosos y colocados de nuevo debajo de la pared del cuerpo, use un soporte de aguja para agarrar la aguja. Pellizque y sostenga un lado del sitio del corte con un par de pinzas estériles, curvas y dentadas. Luego, use el soporte de la aguja para manipular la sutura y cerrar la herida.
Mueva el ratón a una jaula limpia colocada encima de una almohadilla térmica y supervise hasta que el ratón esté activo. Tras la electroporación utilizando electrodos de tipo pinza de tres o un milímetro, el área objetivo marcada con TdTomato se restringió al epitelio del oviducto distal. Con electrodos de tipo pinza de tres milímetros, se apuntó a un área mucho más grande de las ampollas en comparación con apuntar solo a la punta distal más distal, el infundíbulo, utilizando electrodos de tipo pinza de un milímetro.
En la región objetivo, las células electroporadas marcadas por TdTomato se distribuyeron aleatoriamente entre las células no electroporadas. Además, las células electroporadas se restringieron al epitelio de la mucosa y no se observaron en la capa estromal o muscular subyacente. Para confirmar la edición del genoma mediada por CRISPR, se pueden aislar células fluorescentes mediante clasificación FACS para el aislamiento y secuenciación del ADN.
Esto nos permite cuantificar la frecuencia de alelos dirigidos a rastrear las comunicaciones únicas entre la muestra para seguir la evolución coronal in vivo del tumor primario y la metástasis en un entorno inmunocompetente.
