Inyección de células de osteosarcoma intratibial para generar osteosarcoma ortotópico y metástasis pulmonar modelos de ratón

Este protocolo describe la técnica para generar modelos de ratón con osteosarcoma primario y las lesiones de metástasis pulmonar. Mediante la inyección intratibial de células de osteosarcoma, este modelo imita mejor las características de desarrollo clínico del osteosarcoma tumoral. Un número exacto de células de osteosarcoma se inyectan directamente en la tibia utilizando una jeringa de microvolumen, lo que permite tasas de formación de tumores y volúmenes tumorales idénticos.

El día de la inyección de células de osteosarcoma, lave las células dos veces con PBS. Tripsinizar las células con 1,5 mililitros de tripsina al 0,25% durante tres minutos. Luego agregue seis mililitros de medios MEM que contienen suero al 10%.

Recoja las células en un tubo centrífugo de 15 mililitros. Aspire 20 microlitros de suspensión celular en la cámara de la placa de conteo celular y calcule la concentración celular utilizando un contador celular automático. Centrifugar las células a 800 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Aspire el sobrenadante con una pipeta, resuspenda el gránulo celular en una matriz de membrana basal de 8,5 miligramos por mililitro y colóquelos en hielo. Coloque el ratón en posición supina. Sostenga el tobillo del ratón con el pulgar y el dedo índice, y desinfecte el sitio de inyección de la tibia con un hisopo de etanol al 70%.

Gire la articulación del tobillo de cada ratón hacia afuera para mover la tibia y el peroné, y doble la articulación de la rodilla a una posición adecuada hasta que la meseta tibial proximal sea visible a través de la piel. Conecte la aguja a una jeringa de un mililitro y apunte la punta de la aguja hacia el sitio de inyección, paralelo al eje de la tibia. Inserte percutáneamente la aguja para perforar un orificio a través de la plataforma tibial hacia el extremo distal de la tibia.

Cargue la suspensión de células de osteosarcoma previamente colocada en hielo en una jeringa de microvolumen y reemplace la jeringa de un mililitro en la tibia con la jeringa de microvolumen cargada de células de osteosarcoma. Inyecte lentamente aproximadamente 10 microlitros de suspensión de células de osteosarcoma en la tibia de cada ratón acrímico sin aplicar mucha presión. Luego retire la jeringa de microvolumen del sitio de inyección y presione el sitio con el hisopo de algodón durante aproximadamente 30 segundos.

Coloque el ratón de nuevo en una jaula limpia y observe su recuperación durante 10 minutos. Esta figura representa el modelo de ratón con osteosarcoma ortotópico desarrollado a partir de la inyección de células de osteosarcoma intratibial y su forma aislada. Cada semana se observa un aumento gradual en el volumen del tumor.

Las imágenes de rayos X obtenidas de la primera a la sexta semana después de la inyección de células de osteosarcoma marcadas con luciferasa mostraron un aumento gradual en el volumen. Además, la imagen obtenida después de la inyección en la tibia del ratón mostró un crecimiento de osteosarcoma ortotópico in vivo. La metástasis pulmonar causada por la inyección intratibial de las células del osteosarcoma se rastreó con éxito in vivo utilizando un sistema de imágenes en vivo de bioluminiscencia.

La observación bajo un estereomicroscopio reveló colonias metastásicas en los tejidos pulmonares aislados. La tinción de HE en los tejidos pulmonares incrustados en parafina mostró lesiones metastásicas. La aguja debe insertarse percutáneamente en la cápsula articular a través del ligamento rotuliano para perforar un orificio a través de la plataforma tibial hacia la tibia digital girando la jeringa.