Desarrollamos un protocolo rápido y eficiente para generar organoides de cáncer de vejiga a través de la edición de genes ex vivo de células uroteliales normales de ratón portadoras de alelos floxados en genes de interés. Este método ex vivo tiene un flujo de trabajo de una a dos semanas en lugar de años de reproducción de ratones, y es altamente eficiente en la transducción de adenovirus en las deleciones de genes mediadas por Cre. Para comenzar, prepare todos los instrumentos y reactivos estériles, incluidas tijeras, fórceps, DPBS en platos de cultivo de 35 mililitros, etanol al 70%, gasas y toallas de papel limpias.
A continuación, limpie todas las superficies del área de disección y cubra el área de disección con una toalla de papel limpia. Coloque el ratón sacrificado en la gasa en el área de disección y rocíe etanol al 70% en el abdomen del ratón, luego use tijeras de disección estériles, haga una incisión abdominal en la línea media inferior para exponer la vejiga. Ahora, use los fórceps para agarrar y tirar suavemente hacia arriba de la vejiga para identificar la unión ureterovesical bilateral.
Usando tijeras, retire el fondo de ojo de la vejiga, siguiendo la línea límite entre las dos aberturas del uréter y transfiera la vejiga a un plato estéril que contenga 2 mililitros de DPBS, luego retire el tejido graso y conectivo y coloque la vejiga en un nuevo plato que contenga 2 mililitros de DPBS. También retire el adenovirus del almacenamiento de menos 80 grados centígrados y manténgalo en hielo. Para la disociación celular, prepare todos los instrumentos y reactivos estériles como se describe en el manuscrito, luego en un gabinete de bioseguridad, transfiera la vejiga a un plato de 35 milímetros y lávese con 2 mililitros de DPBS estéril.
Recolecte los tejidos de la vejiga de cuatro ratones en un plato con un mililitro de medio de cultivo completo sin FBS despojado de carbón. A continuación, usando una cuchilla quirúrgica, picar cada vejiga en cuatro piezas iguales, luego usando fórceps, desplegar la vejiga para exponer la superficie del urotelio al medio. Transfiera las piezas de la vejiga y el medio a un tubo centrífugo de 15 mililitros.
Lave el plato dos veces con 2 mililitros de medio de cultivo completo sin FBS despojado de carbón y agregue el lavado al tubo de la centrífuga, llevando el volumen total a 5 mililitros. A continuación, agregue una mezcla de colagenasa e hialuronidasa y coloque el tubo horizontalmente en una incubadora de agitador orbital de 37 grados Celsius durante 30 minutos a 200 RPM. Después de la digestión del tejido, agregue un volumen igual de FBS y DPBS con un 10% de brocha de carbón en el tubo y centrífuga a 200 veces g durante 5 minutos.
Después de desechar el sobrenadante, agregue 2 mililitros de sustituto de tripsina en el pellet celular y mezcle bien, luego incube el tubo a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 4 minutos. Después de la incubación, pipetee las células hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una punta P1000 estándar y agregue 5 mililitros de FBS y DPBS con 10% de carbón. Colar las células disociadas a través de un colador de células estériles de 100 micrómetros y recoger la suspensión celular en un tubo de 50 mililitros.
Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros y centrífuga a 200 veces g durante 5 minutos. Después de retirar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 1 mililitro de medio de cultivo completo. Cuente el número de células usando un hemocitómetro y una placa de 0,5 veces 10 a la sexta célula en cada pocillo de una placa de 24 pocillos con 0,5 mililitros de medio de cultivo completo fresco.
A continuación, saque los extractos de matriz de las células de sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm del almacenamiento de menos 20 grados centígrados y descongele en hielo. Además, precaliente una placa de 6 pocillos en una incubadora de células Celsius de 37 grados. Para la transducción adenoviral, agregue 2 microlitros de adenovirus en la placa de 24 pocillos y mezcle bien con las células uroteliales disociadas.
Para mejorar la eficacia de la transducción, realice la espinoculación centrifugando la placa a 300 veces g durante 30 minutos, luego incube la placa a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 1 hora. Transfiera las células y el medio del pozo a un tubo de 15 mililitros y centrífuga a 200 veces g durante 5 minutos. Después de desechar el sobrenadante, agregue 50 microlitros de medio de cultivo completo y mezcle bien con las células en la parte inferior.
A continuación, agregue 140 microlitros de extracto de matriz y mezcle suavemente bien para evitar burbujas de aire, luego cree cúpulas para organoides agregando rápidamente 50 microlitros de la solución por cúpula en la placa de 6 pocillos precalentada. Incuba la placa y deja que las cúpulas se solidifiquen durante 5 minutos. Después de 5 minutos, voltee la placa de 6 pocillos boca abajo y continúe la solidificación durante 25 minutos adicionales.
Después de la incubación, agregue 2.5 mililitros de medio de cultivo completo a cada pozo y coloque la placa en una incubadora para cultivo de organoides. La proteína verde fluorescente se detectó en casi el 100% de las células, lo que sugiere una alta eficiencia de la transducción de adenovirus. La tinción de hematoxilina y eosina y la inmunohistoquímica de tumores organoides de triple knockout mostraron la morfología del carcinoma urotelial de alto grado con expresión proteica positiva de marcadores de subtipo basal de CK5 y p63.
Los alelos floxados no recombinados se detectaron en células uroteliales, no tratadas con adenovirus, mientras que los alelos recombinados se observaron en los organoides triple knockout. En general, se necesitaron de 2 a 3 semanas para formar un tumor subcutáneo de 2 centímetros. La inmunohistoquímica de organoides de triple knockout, xenoinjertos in vivo, mostró expresión positiva de las proteínas CK7, CK5 y p63.
Se detectó expresión negativa para las proteínas CK8 y uroplaquina. El marcador mesénquima, la vimentina, se detectó solo en la cápsula tumoral o en el estroma. La disociación de la vejiga del ratón no debe exceder los 30 minutos.
Un tiempo de disociación más largo puede aumentar en el porcentaje de las células del estroma, como las células endoteliales y los fibroblastos Este enfoque se puede combinar con la clasificación celular o el tipo celular de un adenovirus específico para generar el tipo celular de organoides específicos, como la luz frente a los organoides basales.
