Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias (IOS-2217757) (X.Q.) y el Premio de la Fundación Bronson de la Universidad de Arkansas para Ciencias Médicas (UAMS) (H.Z.).

1. Preparación de las soluciones
<ol><li>Prepare la solución de esterilización de semillas mezclando 15 ml de lejía con 35 ml de agua destilada y 50 μl de Triton X-100.</li>
	<li>Preparar la solución de brefeldina A (BFA) disolviendo el polvo de BFA en etanol hasta una concentración final de 10 mM (stock). Prepare la solución de wortmannina (Wm) disolviendo el polvo de Wm en DMSO hasta una concentración final de 10 mM (stock).</li>
</ol>2. Sembrando las semillas
<ol><li>Alícuota 10-50 semillas de cada una de las plantas transgénicas requeridas en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Agregue 1 ml de solución de esterilización de semillas en cada tubo y mezcle bien invirtiendo el tubo suavemente durante 10 minutos en un agitador.</li>
	<li>Deseche la solución de esterilización de semillas y lave las semillas con 1 ml de agua destilada esterilizada en autoclave cinco veces.</li>
	<li>Agregue 300 μL de agua destilada esterilizada en autoclave en cada tubo y siembre las semillas en medios MS de concentración media que contengan 1% (p/v) de sacarosa y 0,75% (p/v) de agar. Complemente el medio con los antibióticos correspondientes según sea necesario.</li>
	<li>Mantener la placa boca abajo a 4 °C en la oscuridad durante 2 días para sincronizar la germinación.</li>
	<li>Después de 2 días, transfiera la placa a una sala de crecimiento con un ciclo de 16 h de luz/8 h de oscuridad (80 μmol/m2/s1) a 22 °C. Esto se considera el primer día después de la germinación (1 dpg).</li>
	<li>Trasplante las plántulas al suelo a 10 dpg para un mayor crecimiento.</li>
</ol>3. Preparación de plantas transgénicas F1 de dos colores
<ol><li>Cultive plantas transgénicas homocigóticas portadoras de ERL1-YFP (planta A) y plantas transgénicas homocigóticas portadoras de una proteína marcadora marcada con RFP RFP-Ara7 (planta B)20 una al lado de la otra hasta que florezcan en una sala de crecimiento con un ciclo de 16 h de luz/8 h de oscuridad (80 μmol/m2/s1) a 22 °C.</li>
	<li>Elija una inflorescencia joven de la planta A. Mantenga una flor que esté a punto de abrirse en la inflorescencia para los cruces genéticos. Retira todas las flores y siluas más viejas. Además, retire con cuidado las flores más jóvenes y los meristemos florales para evitar confusiones futuras.</li>
	<li>Disecciona suavemente la flor sin abrir quitando los sépalos, los pétalos y el estambre con un par de pinzas afiladas. Solo deje el pistilo en la inflorescencia.</li>
	<li>Tome un estambre maduro de una flor abierta en la planta B y deposite los granos de polen en el estigma del pistilo disecado en la planta A.</li>
	<li>Etiquete esta flor cruzada manualmente indicando su padre, madre y la fecha del cruce genético. Deje que la flor madure y coseche las semillas F1 cuando la sílice se vuelva amarilla / marrón (~ 20 días después del cruce). Compruebe si hay una planta de F1 exitosa que tenga señales YFP y RFP.</li>
</ol>4. Tratamiento farmacológico
<ol><li>Para el tratamiento con BFA, retire los cotiledones de las plántulas de 7 días de edad, sumerja el resto de las plántulas en una solución simulada (etanol al 0,3%) o en una solución de BFA de 30 μM, aplique vacío durante 1 minuto y mantenga la muestra sumergida durante 30 minutos antes de obtener imágenes.</li>
	<li>Para el tratamiento con wortmannin, retire los cotiledones de las plántulas de 7 días de edad, sumerja el resto de las plántulas en una solución de DMSO al 0,25% o en 25 mM de wortmannina, aplique vacío durante 1 minuto y mantenga la muestra sumergida durante 30 minutos antes de obtener imágenes.</li>
	<li>Para el tratamiento al vacío de muestras, en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, agregue 500 μl de la solución de fármaco correspondiente y sumerja las plántulas disecadas en la solución. Conecte firmemente una jeringa de 10 ml al tubo de microcentrífuga y aplique vacío durante 1 minuto (Figura 1). Retire la jeringa y mantenga la muestra en la solución durante el tiempo requerido. Saque con cuidado las plántulas para prepararlas para la obtención de imágenes.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65257/65257fig01.jpg"> Figura 1: Dispositivo de vacío simple. Se conecta una jeringa de 10 ml a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para el tratamiento al vacío. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65257/65257fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
5. Preparación de la muestra para la obtención de imágenes
<ol><li>Diseccione la hoja verdadera de la muestra tratada con una cuchilla de afeitar afilada. Coloque suavemente la hoja verdadera en una gota de agua en un portaobjetos de vidrio y mantenga el lado abaxial hacia arriba. Cubra lentamente la hoja verdadera con un cubreobjetos mientras evita atrapar burbujas.</li>
</ol>6. Imágenes confocales
NOTA: Se utilizó un microscopio confocal de barrido invertido Leica SP8 para obtener imágenes de la señal de fluorescencia de las muestras de este trabajo.
<ol><li>Configuración de la trayectoria del haz<ol><li>Seleccione un láser de 514 nm para la excitación YFP. Utilice una alta potencia láser para aumentar la intensidad de la señal y, así, obtener una alta calidad de imagen. Sin embargo, las potencias del láser superiores al 5% corren el riesgo de fotoblanqueo y la salud de la muestra puede verse afectada. Si la señal de muestra no es demasiado tenue, comience con una intensidad láser baja.</li>
		<li>Active PMT/HyD para la detección y defina los umbrales de la banda de emisión superior e inferior en función del espectro del fluoróforo YFP. Establezca una ventana de detección de 530-570 nm para recoger la señal YFP.</li>
		<li>Imágenes secuenciales para el segundo color: Haga clic en el botón Seq y agregue un nuevo canal. De forma predeterminada, la trayectoria del haz YFP diseñada anteriormente será Seq 1. En la Secuencia 2, seleccione un láser de 561 nm para la excitación RFP y establezca una ventana de detección de 570-630 nm para recopilar la señal RFP.</li>
	</ol></li>
	<li>Configuración de las condiciones de escaneo (Figura 2)<ol><li>Para obtener imágenes de la actividad de tráfico de la membrana subcelular dentro de las células precursoras estomáticas, elija una lente Corr de 63x/1,2 W en el sistema para obtener imágenes.</li>
		<li>El formato se refiere al tamaño de la imagen en píxeles. Comience con 1.024 píxeles x 1.024 píxeles y, a continuación, optimícelo en función del factor de zoom y la configuración del objetivo para obtener una buena resolución de calidad de publicación.</li>
		<li>La velocidad se refiere a la velocidad del cabezal de escaneo a medida que el láser pasa sobre cada píxel. Aunque las velocidades de escaneo lentas a menudo dan como resultado una mejor relación señal-ruido, es posible que no capturen de manera eficiente los eventos de tráfico de membrana que cambian rápidamente. Comience con una velocidad de 400 Hz y optimícela en función de la situación específica de las muestras.</li>
		<li>El factor de zoom se utiliza para acercar una región de interés sin cambiar la lente del objetivo. Comience con un factor de zoom de 1 y optimícelo en función de las necesidades específicas del experimento.</li>
		<li>El promedio de línea se refiere al número de veces que se escaneará cada línea X para obtener un resultado promedio . Un promedio de línea mayor reduce el ruido en la imagen resultante, pero también aumenta el tiempo de escaneo y el tiempo de exposición a la luz láser. Para obtener imágenes de eventos de tráfico de membranas, no utilice un promedio de línea alto. Comience con un promedio de línea de 2x y optimice según sea necesario.</li>
	</ol></li>
	<li>Recopilación de una serie temporal NOTA: Cuando se estudian los eventos de tráfico de membranas, a menudo se necesita una serie temporal para registrar el rápido movimiento de los endosomas subcelulares.<ol><li>En el modo de adquisición, seleccione el modo de escaneo xyt para habilitar la utilidad de serie temporal.</li>
		<li>Decida un período de espera entre los puntos de tiempo en Intervalo de tiempo. Alternativamente, haga clic en Minimizar para tomar las imágenes inmediatamente una tras otra. Se utilizó un intervalo de tiempo de 7 s en el siguiente experimento de series temporales.</li>
		<li>Seleccione Duración e introduzca el tiempo total que tarda en ejecutarse el experimento. Como alternativa, defina el número de fotogramas que se van a recopilar seleccionando Fotogramas (Figura 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Para recopilar la información tridimensional sobre el evento de tráfico de membrana dentro de toda la célula, utilice el modo de escaneo Z-stack. La proyección de máxima intensidad de las imágenes de la pila Z se utiliza a menudo para el análisis.<ol><li>Seleccione el modo de escaneo xyz en el modo de adquisición y, a continuación, se podrá acceder a la utilidad Z-Stack.</li>
		<li>Seleccione la opción Z-wide . En el modo de escaneo, defina la imagen superior y la imagen inferior de la pila Z con los botones Iniciar y Fin .</li>
		<li>Defina el grosor del paso z haciendo clic en el tamaño del paso z. Alternativamente, defina cuántas imágenes tomar para cubrir todo el rango de la pila Z. Para garantizar la coherencia entre las muestras, defina el tamaño del paso z (Figura 4).</li>
	</ol></li>
	<li>Tratamiento de imágenes<ol><li>La proyección de máxima intensidad de las imágenes de la pila z es generada por el software confocal (http://www.leica-microsystems.com). En la pestaña Proceso principal, primero elija el archivo z-stack interesado en la pestaña Abrir proyectos en el extremo izquierdo. Luego, cambie a la pestaña central llamada Herramientas de proceso, seleccione la función Proyección , elija Máximo en el panel desplegable de Método y haga clic en el botón Aplicar . Se generará una imagen de proyección de pila z en la pestaña Proyectos abiertos.</li>
		<li>El vídeo de las imágenes de la serie temporal ha sido generado por Fiji (https://imagej.net/Fiji). En la pestaña Archivo , utilice la función Abrir para abrir todas las imágenes de series temporales en el orden correcto. En la pestaña Imagen , busque la función Apilar y elija Imágenes para apilar para generar un vídeo. Guarde el archivo en formato .avi con la velocidad de fotogramas deseada (5 fotogramas / s para Video 1).</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65257/65257fig02.jpg"> Figura 2: El panel de modo de escaneo de la dimensión XY. El panel de modo de escaneo se utiliza para configurar las condiciones de escaneo de la imagen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65257/65257fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65257/65257fig03.jpg"> Figura 3: La utilidad de serie temporal en el modo de escaneo xyt. La utilidad de serie temporal se utiliza para configurar las condiciones de imagen para recopilar consecutivamente una serie de imágenes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65257/65257fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65257/65257fig04.jpg"> Figura 4: La utilidad z-stack en el modo de escaneo xyz. La utilidad z-stack se utiliza para configurar las condiciones de imagen para recopilar una serie de imágenes en el eje z. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65257/65257fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Investigación espacio-temporal de la dinámica de ERL1 mediante imágenes confocales

<ol>
	<li>Aniento, F., Sanchez de Medina Hernandez, V., Dagdas, Y., Rojas-Pierce, M., Russinova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+endomembrane+trafficking+in+plants.">Molecular mechanisms of endomembrane trafficking in plants.</a> Plant Cell. 34 (1), 146-173 (2022).</li><li>Sigismund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+and+signaling:+Cell+logistics+shape+the+eukaryotic+cell+plan.">Endocytosis and signaling: Cell logistics shape the eukaryotic cell plan.</a> Physiological Reviews. 92 (1), 273-366 (2012).</li><li>Lyu, Z., Genereux, J. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomagen+positively+regulates+stomatal+density+in+Arabidopsis.">Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis.</a> Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).</li><li>Kondo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+density+is+controlled+by+a+mesophyll-derived+signaling+molecule.">Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule.</a> Plant &amp; Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).</li><li>Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+interaction+of+ligand-receptor+pairs+specifying+stomatal+patterning.">Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning.</a> Genes &amp; Development. 26 (2), 126-136 (2012).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+manifold+actions+of+signaling+peptides+on+subcellular+dynamics+of+a+receptor+specify+stomatal+cell+fate.">The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate.</a> Elife. 9, e58097 (2020).</li><li>MacAlister, C. A., Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulators+of+stomatal+lineage+signal+transduction+alter+membrane+contact+sites+and+reveal+specialization+among+ERECTA+kinases.">Modulators of stomatal lineage signal transduction alter membrane contact sites and reveal specialization among ERECTA kinases.</a> Developmental Cell. 38 (4), 345-357 (2016).</li><li>Le, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin+transport+and+activity+regulate+stomatal+patterning+and+development.">Auxin transport and activity regulate stomatal patterning and development.</a> Nature Communications. 5, 3090 (2014).</li><li>Geldner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+GNOM+ARF-GEF+mediates+endosomal+recycling,+auxin+transport,+and+auxin-dependent+plant+growth.">The Arabidopsis GNOM ARF-GEF mediates endosomal recycling, auxin transport, and auxin-dependent plant growth.</a> Cell. 112 (2), 219-230 (2003).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+regulation+of+stomatal+differentiation+potential+by+EPF1+and+ERECTA-LIKE1+ligand-receptor+signaling.">Autocrine regulation of stomatal differentiation potential by EPF1 and ERECTA-LIKE1 ligand-receptor signaling.</a> Elife. 6, 24102 (2017).</li><li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes.">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).</li><li>Leighton, R. E., Alperstein, A. M., Frontiera, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+super-resolution+imaging+techniques.">Label-free super-resolution imaging techniques.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 15 (1), 37-55 (2022).</li><li>Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinning-disk+confocal+microscopy:+Present+technology+and+future+trends.">Spinning-disk confocal microscopy: Present technology and future trends.</a> Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+column+and+whole-brain+imaging+with+molecular+contrast+and+nanoscale+resolution.">Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution.</a> Science. 363 (6424), (2019).</li><li>Nwaneshiudu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+confocal+microscopy.">Introduction to confocal microscopy.</a> Journal of Investigative Dermatology. 132 (12), (2012).</li><li>Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+microscopy.">Multi-photon microscopy.</a> Current Protocols. 3 (1), 634 (2023).</li></ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

El sistema de endomembranas separa el citoplasma de una célula eucariota en diferentes compartimentos, lo que permite la función biológica especializada de estos orgánulos. Para llevar las proteínas de carga y las macromoléculas a su destino final en el momento adecuado, se guían numerosas vesículas para que se transporten entre estos orgánulos. Los eventos de tráfico de membranas altamente regulados juegan un papel fundamental en la viabilidad, el desarrollo y el crecimiento de las células. El mecanismo que r...

El tráfico de membrana es un proceso celular conservado que distribuye los componentes de la membrana (también conocidos como cargas), incluidas proteínas, lípidos y otros productos biológicos, entre diferentes orgánulos dentro de una célula eucariota o a través de la membrana plasmática hacia y desdeel espacio extracelular. Este proceso es facilitado por una colección de membranas y orgánulos denominada sistema de endomembranas, que consiste en la membrana nuclear, el retículo endoplásmico, el aparato de Golgi, las vacuolas/lisosomas, la membrana plasmática y múltiples endosomas1. El sistema de endomembranas permite la modificación, el empaquetado y el transporte de los componentes de la membrana mediante vesículas dinámicas que se desplazan entre estos orgánulos. Los eventos de tráfico de membranas son cruciales para el desarrollo, el crecimiento y la adaptación ambiental de las células y, por lo tanto, están sujetos a una regulación estricta y compleja2. En la actualidad, se han desarrollado y aplicado múltiples enfoques en biología molecular, biología química, microscopía y espectrometría de masas al campo del tráfico de membranas y han avanzado enormemente en la comprensión de la regulación espacio-temporal del sistema de endomembranas 3,4. La biología molecular se utiliza para las manipulaciones genéticas clásicas de los supuestos actores implicados en el tráfico de membranas, como la alteración de la expresión génica de la proteína de interés o el etiquetado de la proteína de interés con ciertas etiquetas. Las herramientas de la biología química incluyen el uso de moléculas que interfieren específicamente con el tráfico de ciertas rutas 4,5. La espectrometría de masas es potente para identificar los componentes de un orgánulo que ha sido aislado mecánicamente por aproximaciones bioquímicas 3,4. Sin embargo, el tráfico de membranas es un proceso biológico dinámico, diverso y complejo1. Para visualizar el proceso de tráfico de membranas en células vivas en diversas condiciones, la microscopía óptica es una herramienta esencial. Se ha avanzado continuamente en las técnicas avanzadas de microscopio para superar los desafíos en la medición de la eficiencia, cinética y diversidad de los eventos4. Aquí, este estudio se centra en las metodologías ampliamente adoptadas en biología química/farmacológica, biología molecular y microscopía para estudiar los eventos de tráfico de membrana en un sistema naturalmente simplificado y experimentalmente accesible, el proceso de desarrollo de estomas.
Los estomas son microporos en las superficies aéreas de las plantas que se abren y cierran para facilitar el intercambio de gases entre las células internas y el medio ambiente 6,7,8. Por lo tanto, los estomas son esenciales para la fotosíntesis y la transpiración, dos eventos que son cruciales para la supervivencia y el crecimiento de las plantas. El desarrollo de los estomas se ajusta dinámicamente mediante señales ambientales para optimizar la adaptación de la planta al entorno9. La identificación de la proteína receptora Too Many Mouths (TMM) abrió la puerta a una nueva era de investigación de los mecanismos moleculares del desarrollo estomatológico en la planta modelo Arabidopsis thaliana10. Después de unas pocas décadas, se ha identificado una vía de señalización clásica. De arriba a abajo, esta vía incluye un grupo de ligandos de péptidos secretores de la familia de los factores de patrón epidérmico (EFP), varias quinasas del receptor de repeticiones ricas en leucina (LRR) de la superficie celular de la familia EREECTA (ER), la proteína del receptor LRR TMM, una cascada de MAPK y varios factores de transcripción de bHLH, incluidos SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA y SCREAM (SCRM)11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Trabajos previos indican que uno de los receptores quinasas, ER-LIKE 1 (ERL1), demuestra comportamientos subcelulares activos sobre la percepción de EPF20. ERL2 también transita dinámicamente entre la membrana plasmática y algunos orgánulos intracelulares27. El bloqueo de los pasos de tráfico de membrana causa un patrón estomático anormal, lo que resulta en grupos de estomas en la superficie de la hoja28. Estos resultados sugieren que el tráfico de membranas juega un papel esencial en el desarrollo de los estomas. En este estudio se describe un protocolo para investigar espacio-temporalmente la dinámica de ERL1 mediante el análisis de colocalización subcelular proteína-proteína combinado con el tratamiento farmacológico mediante algunos inhibidores del tráfico de membrana.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL syringes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD309695</td>
			<td>Vacuum samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A (BFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7651</td>
			<td>membrane trafficking drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Lecia SP8 TCS with LAS-X software package</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-402</td>
			<td>Genetic cross</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>NIH</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica LAS AF software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>http://www.leica-microsystems.com</td>
			<td>Image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transgenic seeds of ERL1-YFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transgenic seeds of RFP-Ara7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wortmannin (Wm)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W1628</td>
			<td>membrane trafficking drug</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

image-based methods to study membrane trafficking events in stomatal lineage cells

En las células eucariotas, los componentes de la membrana, incluidas las proteínas y los lípidos, se transportan espacio-temporalmente a su destino dentro del sistema de endomembranas. Esto incluye el transporte secretor de proteínas recién sintetizadas a la superficie celular o al exterior de la célula, el transporte endocítico de cargas extracelulares o componentes de la membrana plasmática dentro de la célula, y el transporte de reciclaje o transporte de cargas entre los orgánulos subcelulares, etc. Los eventos de tráfico de membrana son cruciales para el desarrollo, el crecimiento y la adaptación ambiental de todas las células eucariotas y, por lo tanto, están sujetos a una estricta regulación. Las quinasas receptoras de la superficie celular, que perciben las señales de ligandos del espacio extracelular, experimentan tanto el transporte secretor como el endocítico. Aquí se describen los enfoques comúnmente utilizados para estudiar los eventos de tráfico de membrana utilizando una quinasa receptora de repetición rica en leucina localizada en la membrana plasmática, ERL1. Los enfoques incluyen la preparación del material vegetal, el tratamiento farmacológico y la configuración de imágenes confocal. Para monitorizar la regulación espacio-temporal de ERL1, en este estudio se describe el análisis de colocalización entre ERL1 y una proteína marcador corporal multivesicular, RFP-Ara7, el análisis de series temporales de estas dos proteínas y el análisis de la pila z de ERL1-YFP tratada con los inhibidores del tráfico de membrana brefeldina A y wortmannina.

Membrane traffic is a conserved cellular process that distributes membrane components (also known as cargoes), including proteins, lipids, and other biological products, between different organelles within a eukaryotic cell or across the plasma membrane to and from the extracellular space1. This process is facilitated by a collection of membranes and organelles named the endomembrane system, which consists of the nuclear membrane, the endoplasmic reticulum, the Golgi apparatus, the vacuole/lysosomes, the plasma membrane, and multiple endosomes1. The endomembrane system enables the modification, packaging, and transport of membrane components using dynamic vesicles that shuttle between these organelles. Membrane trafficking events are crucial to cell development, growth, and environmental adaptation and, thus, are under stringent and complex regulation2. Currently, multiple approaches in molecular biology, chemical biology, microscopy, and mass spectrometry have been developed and applied to the field of membrane trafficking and have greatly advanced the understanding of the spatiotemporal regulation of the endomembrane system3,4. Molecular biology is used for classical genetic manipulations of the putative players involved in membrane trafficking, such as altering the gene expression of the protein of interest or labeling the protein of interest with certain tags. Tools in chemical biology include the usage of molecules that specifically interfere with the traffic of certain routes4,5. Mass spectrometry is powerful for identifying the components in an organelle that has been mechanically isolated by biochemical approaches3,4. However, membrane traffic is a dynamic, diverse, and complex biological process1. To visualize the membrane trafficking process in live cells under various conditions, light microscopy is an essential tool. Continuous progress has been made in advanced microscope techniques to overcome the challenges in measuring the efficiency, kinetics, and diversity of the events4. Here, this study focuses on the widely adopted methodologies in chemical/pharmacological biology, molecular biology, and microscopy to study membrane trafficking events in a naturally simplified and experimentally accessible system, the stomatal developmental process.
Stomata are micropores on plant aerial surfaces that open and close to facilitate gas exchange between the inner cells and the environment6,7,8. Hence, stomata are essential for photosynthesis and transpiration, two events that are crucial for plant survival and growth. Stomatal development is dynamically adjusted by environmental cues to optimize the plant&#39;s adaptation to the surroundings9. Dating back to studies in 2002, the identification of the receptor protein Too Many Mouths (TMM) opened the door to a new era of investigating the molecular mechanisms of stomatal development in the model plant Arabidopsis thaliana10. After just a few decades, a classical signaling pathway has been identified. From upstream to downstream, this pathway includes a group of secretory peptide ligands in the epidermal patterning factors (EFP) family, several cell-surface leucine-rich-repeat (LRR) receptor kinases in the EREECTA (ER) family, the LRR receptor protein TMM, a MAPK cascade, and several bHLH transcription factors including SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA, and SCREAM (SCRM)11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Previous work indicates that one of the receptor kinases, ER-LIKE 1 (ERL1), demonstrates active subcellular behaviors upon EPF perception20. ERL2 also dynamically traffics between the plasma membrane and some intracellular organelles27. Blocking the membrane trafficking steps causes abnormal stomatal patterning, resulting in stomatal clusters on the leaf surface28. These results suggest that membrane traffic plays an essential role in stomatal development. This study describes a protocol to spatiotemporally investigate the ERL1 dynamics using protein-protein subcellular co-localization analysis combined with pharmacological treatment using some membrane trafficking inhibitors.

Autor destacado: Métodos basados en imágenes para estudiar los eventos de tráfico de membrana en células de linaje estomática  

Métodos basados en imágenes para estudiar los eventos de tráfico de membrana en células de linaje estomática

This technique studies the membrane trafficking events in stomatal development, the micropores on plant aerial surface, to facilitate photosynthesis and the transpiration. Various techniques are used to study plant stomatal development. This includes molecular biology, cell biology or microscopy, chemical biology, mass spectrometry, biochemistry, and structural biology.Individual stomata form asynchronously. Each stoma is formed by three transcend cell fate transitions. So collecting enough stomata lineage cells at a particular cell fate is one of the big challenges.Membrane trafficking is essential for cell survival and growth. Stomata lineage cell is no exception. This protocol addresses the commonly used approach to study membrane trafficking events in stomata lineage cells.Plants face challenging environment in the face of climate change. Stomata are passages for plant gas exchange, and are highly flexible to environmental stress for adaptation. We are interested in studying how abiotic stress affects the stomata development by focusing on the membrane trafficking of certain proteins in stomata lineage cells.

Un estudio previo indicó que ERL1 es un receptor quinasa activo que experimenta eventos dinámicos de tráfico de membrana20. ERL1 es una quinasa transmembrana del receptor LRR en la membrana plasmática. La ERL1 recién sintetizada en el retículo endoplásmico se procesa en los cuerpos de Golgi y se transporta posteriormente a la membrana plasmática. Las moléculas ERL1 de la membrana plasmática pueden percibir ligandos EPF utilizando su dominio18 LRR extracelular. Tra...

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Aquí se introducen varios métodos de uso común para estudiar los eventos de tráfico de membrana de una quinasa receptora de membrana plasmática. Este manuscrito describe protocolos detallados que incluyen la preparación del material vegetal, el tratamiento farmacológico y la configuración de imágenes confocales.

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...

Esta técnica estudia los eventos de tráfico de membrana en el desarrollo de los estomas, los microporos en la superficie aérea de las plantas, para facilitar la fotosíntesis y la transpiración. Se utilizan diversas técnicas para estudiar el desarrollo de los estomas de las plantas. Esto incluye biología molecular, biología celular o microscopía, biología química, espectrometría de masas, bioquímica y biología estructural.Los estomas individuales se forman de forma asíncrona. Cada estoma está formado por tres transiciones de destino celular trascendentes. Por lo tanto, recolectar suficientes células del linaje de los estomas en un destino celular particular es uno de los grandes desafíos.El tráfico de membranas es esencial para la supervivencia y el crecimiento celular. La célula del linaje de los estomas no es una excepción. Este protocolo aborda el enfoque comúnmente utilizado para estudiar los eventos de tráfico de membrana en las células del linaje de los estomas.Las plantas se enfrentan a un entorno desafiante frente al cambio climático. Los estomas son pasajes para el intercambio de gases de las plantas y son muy flexibles al estrés ambiental para su adaptación. Estamos interesados en estudiar cómo el estrés abiótico afecta el desarrollo de los estomas, centrándonos en el tráfico de membrana de ciertas proteínas en las células del linaje de los estomas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

550 vistas.  Rutgers University. Esta técnica estudia los eventos de tráfico de membrana en el desarrollo de los estomas, los microporos en la superficie aérea de las plantas, para facilitar la fotosíntesis y la transpiración. Se utilizan diversas técnicas para estudiar el desarrollo de los estomas de las plantas. Esto incluye biología molecular, biología celular o microscopía, biología química, espectrometría de masas, bioquímica y biología estructural.Los estomas individuales se forman de forma asíncr...

Video: Autor destacado: Métodos basados en imágenes para estudiar los eventos de tráfico de membrana en células de linaje estomática  

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane system. This includes the secretory transport of newly synthesized proteins to the cell surface or the outside of the cell, the endocytic transport of extracellular cargoes or plasma membrane components into the cell, and the recycling or shuttling transport of cargoes between the subcellular organelles, etc. Membrane trafficking events are crucial to the development, growth, and environmental adaptation of all eukaryotic cells and, thus, are under stringent regulation. Cell-surface receptor kinases, which perceive ligand signals from the extracellular space, undergo both secretory and endocytic transport. Commonly used approaches to study the membrane trafficking events using a plasma membrane-localized leucine-rich-repeat receptor kinase, ERL1, are described here. The approaches include plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup. To monitor the spatiotemporal regulation of ERL1, this study describes the co-localization analysis between ERL1 and a multi-vesicular body marker protein, RFP-Ara7, the time series analysis of these two proteins, and the z-stack analysis of ERL1-YFP treated with the membrane trafficking inhibitors brefeldin A and wortmannin.

Several commonly used methods are introduced here to study the membrane trafficking events of a plasma membrane receptor kinase. This manuscript describes detailed protocols including the plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup.

Investigación

Biología

﻿Preparation of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana

Preparation of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana  

To begin, grow homozygous transgenic Arabidopsis thaliana plants bearing ERL1-YFP and a red fluorescent protein, or RFP-labeled marker protein RFP ARA7 side-by-side in a growth room until flowering. On the young inflorescence of plant A, remove all the older flowers and calyx, except for one recently opened flower. Carefully remove the younger flowers and floral merostems.In the recently opened flower, remove the sepals, petals, and stamen using a pair of sharp tweezers, leaving only the pistil on the inflorescence. From plant B, take mature stamen from an opened flower and deposit the pollen grains into the stigma of the dissected pistil of plant A.Label this manually crossed flower, indicating its parents and the date of the genetic cross. When the calyx turns yellow or brown, harvest the F1 seeds to check for a successful F1 plant having yellow fluorescent protein, or YFP, and RFP signals.

Preparación de Arabidopsis thaliana transgénica F1 de dos colores

Pharmacological Analysis of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana

Pharmacological Analysis of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana   

To begin the pharmacological analysis of dual-colored F1 Arabidopsis thaliana, dissect and remove the cotyledons of seven-day old transgenic seedlings. Add 500 microliters of a 30-micromolar Brefeldin A, or BFA solution, in a 1.5-milliliter micro-centrifuge tube. Immerse the dissected seedlings in it.Tightly attach a 10-milliliter syringe to the micro-centrifuge tube and apply a vacuum for one minute. Remove the syringe before incubating the sample in the solution for 30 minutes before imaging. Next, immerse the dissected seven-day old seedling into 25-millimolar wortmannin.Apply the vacuum for one minute before incubating the immersed sample for 30 minutes. Examining ERL-1 trafficking routes in transgenic plants showed that 30 minutes of exposure to Brefeldin A solution resulted in ERL-1-YFP detection in large compartments known as BFA bodies. It indicated that Brefeldin A could block ERL-1 trafficking suggesting recycling or endocytosis of ERL-1.When transgenics were treated with wortmannin for 30 minutes, ring-like structures called WM bodies were highlighted by ERL-1-YFP. It showed that ERL-1-YFP were transported to multivesicular bodies indicating that ERL-1 followed the route to vacuoles for degradation.

Análisis farmacológico de la Arabidopsis thaliana transgénica F1 de dos colores

Sample Preparation and Confocal Imaging of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana

Sample Preparation and Confocal Imaging of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana   

To begin the sample preparation, dissect the true leaf from the pharmacologically treated Arabidopsis thaliana transgenic sample using a sharp razor blade. Place the true leaf on a glass slide in a drop of water with the abaxial side up. Slowly cover the true leaf with a cover slip without air bubbles.For imaging, set up the beam path by selecting a 514-nanometer laser for yellow fluorescent protein, or YFP excitation. Obtain high image quality by using high laser power. Turn on PMT or HYD and define the upper and lower emission band thresholds based on the spectrum for the YFP fluorophore.Set a detection window of 530 to 570 nanometers to collect the YFP signal. for the sequential image of the second color, click on the seek button and add a new channel. In seek two, select a 555-nanometer laser for the red fluorescent protein, or RFP excitation, and set a detection window of 570 to 630 nanometers to collect the RFP signal.Select a 63X, 1.2W core lens on the system for imaging the subcellular membrane traffic activity within stomatal precursor cells. Start the format with an image size of 1024 by 1024 pixels, then optimize it based on the zoom factor and the objective settings for a good resolution. Next, set up the speed of the scan head, starting with a speed of 400 hertz, and optimize this based on the specific situation of the samples.To zoom on a region of interest without changing the objective lens, enter a zoom factor of one and optimize this based on the specific needs of the experiment. The line average refers to the number of times each X line will be scanned to obtain an average result. Start with a 2X line average For imaging the membrane trafficking events and optimize as needed.select the XYT scan mode in the acquisition mode to enable the time series utility. Next, select the waiting period between the time points under time interval. Define the number of frames to be collected by selecting frames.Use the Z-stack scan mode with the maximum intensity projection to collect the three-dimensional information regarding the membrane trafficking event within The entire cell. Then select the XYZ scan mode in acquisition mode and then the Z-stack utility will become accessible. Select the Z wide option.Under the scan mode, define the Z stack's top and bottom images using the begin and end buttons. Next, define the thickness of the Z step by clicking on the Z step size. To process the image, click on the primary process tab in Confocal software.Under the open projects tab on the far left side, select the interested Z-stack file. Then, in the middle tab named process tools, select the projection function. Choose maximum in the dropdown panel of method and click on the apply button.A Z-stack projection image will be generated under the open projects tab. To generate the video from the time series images, click the file tab in Fiji software and open function to open all the time series images one by one in the correct order. Alternatively, drag the images onto image J to open the data in the correct order.Then find the stack function in the image tab and choose images to stack to generate a video. Once done, save the file in the avi format with the desired frame rate. In the true leaf of seven-day-old transgenic plants bearing ERL1 promoter ERL1 YFP, scattered cells were highlighted by the YFP signal where ERL1 YFP labeled the plasma membrane.Multiple punctate signals were also observed, suggesting that ERL1 was also localized to the endosomes. RFP Ara7 highlighted multiple punctate signals in almost all the cells, indicating the multivesicular bodies, or MVBs, in these cells. When RFP Ara7 merged with the ERL1 YFP signal, most punctates overlapped, suggesting that some ERL1 YFP molecules were transported to the MVBs.Time series of true leaves bearing ERL1 YFP and MVB marker protein RFP Ara7 showed that YFP-labeled endosomes moved together with RFP Ara7 within the stomatal lineage cells. It confirmed that ERL1 YFP was localized to the multivesicular bodies.