We are indebted to Xuefei Yang, Sabine Both, Lin Chen and Kaitian Wang for coordinating the fieldwork and establishing the BEF-China experiment. We are also grateful to the whole BEF-China research group for their general support. BEF-China is mainly funded by the German Research Foundation (DFG FOR 891/1 and 2) and funding for this particular project was provided by the German Research Foundation to H.B. (DFG BR 1698/9-2). We are also thankful for the travel grants and summer schools financed by the Sino-German Centre for Research Promotion in Beijing (GZ 524, 592, 698, 699 and 785). In addition we would like to thank David Eichenberg, Michael Staab, Katja Grotius, Silvana Tornack, Lin Chen, and Shouren Zhang for their support in the field and in the lab.

1. Conductancia estomática <ol><li> Las mediciones de conductancia estomática NOTA: Los autores hicieron uso de un tipo simple de porómetro estado estacionario (Decagon SC1). El diseño de la porometer tiene la ventaja de pequeño tamaño, funcionamiento manual intuitivo y alta fiabilidad. Cuando se mide la conductancia estomática en el campo, asegúrese de reducir al mínimo la distancia entre los individuos medidos para un ciclo de medición repetida a ser la más eficiente posible. </li><li> Elija las hojas de diferentes especies y los individuos de acuerdo con un patrón reproducible (misma altura, la misma exposición, misma posición dentro de la planta, si es posible sólo desde el mismo nodo, y sólo de una categoría; sol o sombra hojas, etc.). <ol><li> Sólo medida deja en condición sana, no dañada y plenamente desarrollado. Marque las hojas de los individuos (por ejemplo, con las ataduras de cables o cinta de color), para asegurar que las mediciones repetidas se realizan en la misma hoja. NOTA: Measurelemen- de conductancia estomática deben hacerse sólo en la superficie de la hoja al mismo tiempo evitar la nervadura central y fuertes venas de las hojas. </li><li> Comience mediciones en las primeras horas de la mañana antes del amanecer tomar de cinco a diez mediciones repetidas hasta que los valores de conductancia de estomas muestra una clara disminución al mediodía. NOTA: Un curso diario de las mediciones entregará buenos datos para el análisis de las relaciones entre vpd y conductancia estomática. </li></ol></li><li> Mediciones VPD <ol><li> Con cada g de medición S, registrar la temperatura y la humedad relativa preferiblemente con registradores portátiles para medir directamente las condiciones en la posición de la misma hoja. Para el cálculo del déficit de presión de vapor, utilizar la fórmula agosto-Roche Magnus 15. </li></ol></li></ol><img alt="Ecuación 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52738/52738eq1.jpg" width="300" /> = saturación de presión de vapor de agua e s [hPa] <ol start="4"><li> Modelo g S - respuesta vpd <ol><li> Ahora especies sabias argumentales todos los datos g S contra vpd, combinando todos los cursos diarios de hojas individuales en un análisis por cada especie. Extraer el valor máximo observado en los datos de la conductancia estomática buscando el valor máximo. Para escalar el modelo para la comparabilidad especies sabias, dividir a los valores observados a través del valor máximo observado para la especie (g S / g SMAX). </li><li> Para cada especie, regresar los logits de g S (g S / g SMAX) para vpd y el término cuadrático de vpd utilizando un modelo lineal generalizado con una distribución de error binomial (a, byc representan parámetros de regresión): </li></ol></li></ol><img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/52738/52738eq2.jpg" width="300" /><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52738/52738fig1highres.jpg" wIDþ = &quot;700&quot; /&gt; Figura 1. Ejemplo de los valores trazados y el modelo ajustado a g S -. Vpd conductancia estomática representa en función del déficit de presión de vapor para la especie Liquidambar formosana. Puntos vacíos representan los valores observados. (A) de la conductancia estomática máxima, el vpd a la máxima conductancia estomática y la media de la conductancia estomática se extrajo de la conductancia absoluta por lo tanto no escalado estomática (g S) de datos. (B) los datos de conductancia estomática Scaled (S / g SMAX g) se representaron para extraer los parámetros relativos (que se muestra como puntos negros) 20. Vuelva a imprimir con permiso de 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52738/52738fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52738/52738fig2highres.jpg" wiDTH = &quot;400&quot; /&gt; Figura 2. Todos los modelos ajustados para todas las especies. Gráficos de modelo para los datos de la conductancia estomática a la regresión vpd para todas las especies. Especies de hoja perenne son representados por líneas negras, especies de hojas caducas por líneas rojas 20. Vuelva a imprimir con permiso de 20. NOTA: El uso de los logits lugar de regresión g S directamente a vpd, conduce hasta el punto que modeló valores máximos no superen g SMAX y que g S se aproxima a 0 a alta vpd. <ol start="5"><li> Extraer parámetros de la regulación de los estomas para cada especie <ol><li> Calcule g modelado valores SMAX absolutos (MAXFIT en la Figura 1B). Para ello, el cálculo de la vpd a la máxima conductancia estomática de ajuste de la primera derivada de 1.4.2 a cero, lo que da vpd gsMaxFit = -b / 2a. Inserte vpd gsMaxFit en la fórmula de 1.4.2 y elevar a la potencia de correo para obtener MAXFIT. Calcular el mean de todas las mediciones de conductancia por especie (ver Figura 1 A). NOTA: El uso de software estadístico R (http://www.r-project.org). </li><li> Para calcular los valores relativos, del modelo a escala (g S / g SMAX), extraer la conductancia estomática y los valores VPD para los dos puntos siguientes: (1) la conductancia estomática y vpd en el máximo de la modelo (MAXFIT) y (2) vpd en el segundo punto de inflexión de la curva (véase la Figura 1B). Multiplique estos valores por g SMAX para obtener valores absolutos g S para estos puntos. Vea la Figura 2 para una superposición completa de los modelos individuales de los 39 especies analizadas. </li></ol></li></ol> 2. Las mediciones de los estomas Rasgos <ol><li> Tomar muestras preferiblemente de exactamente las mismas hojas que se han utilizado para las mediciones de conductancia estomática. Si esto no es posible, aplicar el mismo procedimiento de selección que se aplicó para elegir las hojaspara las mediciones de conductancia estomática, preferiblemente en los mismos individuos. </li><li> Aplicar una fina capa de incoloros, de secado rápido esmalte de uñas (prueba de diferentes marcas, algunos son más adecuados que otros) a una muestra fresca. Si las muestras no pueden ser procesadas de inmediato, guárdelos en un 70% de alcohol. Después de que el esmalte de uñas se ha secado, pelar suavemente la impresión de la hoja y de proceder para el análisis microscópico, como con una muestra normal de la hoja. NOTA: En el caso de las hojas con una alta densidad de tricomas una etapa anterior de la aplicación de hidróxido de sodio o una solución 1: 1 de peróxido de ácido acético y oxígeno puede conducir a mejores resultados. </li><li> Análisis microscopio óptico <ol><li> Conecte una cámara a un microscopio óptico capaz de aumentos entre 40X a 400X. Después de la cámara está conectada al microscopio, que coincida con las imágenes tomadas a la ampliación óptica y resolución de la imagen, por ejemplo, con la ayuda de una escala. </li><li> Empleando i de código abiertosoftware de procesamiento de mago como ImageJ 16 analizar estas fotos. <ol><li> Dibuja una forma con la herramienta de forma de la herramienta de análisis de imagen en la imagen en un área sin suciedad, huellas digitales, las áreas dañadas, o grandes venas de la hoja. Cuente estomas en esta área y en total de al menos 50 000 m 2 por muestra. </li><li> Mida guardia estomática longitud de la célula y la longitud de los poros. Calcular el número de estomas por mm2. Calcular el índice estomático como la relación de la densidad de los estomas para el número de células epidérmicas por mm 2. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Evaluación de la vena de la hoja Rasgos NOTA: Para la evaluación de los rasgos de la vena de la hoja, una modificación de un protocolo de Saco y Scoffoni 17 fue empleado. <ol><li> preparación de la muestra NOTA: Para optimizar la visibilidad de las venas de las hojas, las hojas se blanquea primero y luego se tiñeron con safranina y verde malaquita. <ol><li> Para blanquear el leaves, a dejar al menos 72 horas en el 50% de solución de decolorante (prueba de diferentes marcas, de nuevo algunos podrían trabajar mejor). Alternativamente, use solución al 5% o solución de KOH al 10% o 25% de solución de NaOH H 2 O 2. </li><li> Calentar la solución hasta 30 ° C o combinar las diferentes soluciones de la etapa 3.1.1 para obtener mejores efectos. Enjuague varias veces con agua después. Adaptar el proceso de blanqueo para las especies específicas, dependiendo de sus características hojas. NOTA: Más grueso hojas pueden necesitar períodos de baño de solución y, o las soluciones más agresivas largos. Hojas tiernas más delgadas y más pueden ser blanqueados en un grado satisfactorio en menos de 72 horas. </li><li> Para colorear las hojas colocarlos en etanol al 100%. Ellos Colorea por 2 - 30 min en solución safranina 1%. Para mejorar la coloración, añadir un tratamiento adicional con 1% de solución de verde de malaquita solamente durante varios segundos. Adaptar el protocolo para todas las especies en términos de tiempo y la intensidad para lograr resultados óptimos. Enjuague sítiempos Veral en el agua después. Si las hojas son de manchado profundamente, algún tiempo en etanol o decolorante puede ayudar. </li></ol></li><li> Análisis de las muestras <ol><li> Analiza las hojas con un escáner de luz de fondo a una resolución de aproximadamente 1200 dpi. Coinciden con las exploraciones adoptadas para la resolución de la imagen, por ejemplo, con la ayuda de una escala, para asegurarse de que la longitud de píxeles se remonta a las medidas absolutas de longitud de la hoja escaneada. </li><li> Medir el área, perímetro, longitud y anchura de las hojas. Calcula varios índices, por ejemplo, la longitud / anchura y la circunferencia 2 / área. Corte un 1 por 1 cm rectángulo de en medio de la imagen. Medir el diámetro de las venas de primero y segundo orden (no incluya la principal vena central). Mida la longitud de todas las venas de primer orden en este cuadrante (densidad vena). </li></ol></li></ol> 4. Evaluación de Otros Leaf Rasgos NOTA: Los asnos rasgos foliares típicos como específicaárea foliar (SLA), hoja de materia seca (CMSH), área foliar, contenido de elementos, hoja hábito, hoja Pinnado, hoja de tipo compuesto, hoja tipo margen etc. siguientes establecido protocolos 18,19. <ol><li> Rasgos de la hoja de observación <ol><li> Evaluar Pinnado hoja, hoja de tipo compuesto, hoja tipo de margen y la presencia de nectarios extraflorales 18,19 través de la observación en el campo. </li></ol></li><li> Rasgos de la hoja de análisis <ol><li> Recoger muestras de hojas frescas, preferentemente en los mismos individuos que los utilizados para las otras medidas, para la determinación del área específica foliar (SLA), área foliar y la hoja de contenido de materia seca (CMSH) 18,19. Después de 48 horas en el horno de secado a 80 ° C, mida el contenido de elementos y relaciones, de preferencia en las mismas hojas. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Los parámetros de la regulación de los estomas extraídos por el método presentado en este trabajo ponen de relieve la importancia de los rasgos de los estomas, tales como la densidad de estomas y el índice de estomas. Estas nuevas relaciones demuestran el potencial de vincular los parámetros de los modelos fisiológicos para morfológicas, anatómicas y de la hoja química rasgos de 20. En comparación con otros métodos, el presente enfoque tiene la ventaja de capturar un valor vpd única e inequívoca en la que la conductancia estomática es el regulado de la mitad de la g modelado s máximo. De todos los pasos descritos en el protocolo de las más críticas son las mediciones de conductancia estomática. Debido a la regulación multifactorial de las condiciones climáticas de la conductancia ambiente estomas tienen una fuerte influencia en g S. Mediciones de conductancia estomática a alta humedad relativa y baja intensidad de luz pueden ser poco fiables 21-23. Con respecto a morfológicas y anatrasgos omical, el protocolo siempre deben ser adaptados a las especies objetivo incluidas en el estudio. En particular en el análisis de la densidad de la vena, la duración de la decoloración y la tinción de las hojas debe ser variada, dependiendo de la estructura de la hoja y tenacidad. Posibles limitaciones del método incluyen especies, para los que son imposibles o complicado y propenso a errores debido a formas de hojas extraordinarias mediciones de conductancia estomática. Esto puede incluir coníferas y pastos con láminas foliares muy estrechos. Nuestros resultados confirman en parte la primera hipótesis de una relación entre los parámetros de la conductancia estomática y rasgos de la hoja del espectro de la hoja de la economía (LES), que corresponde a varios otros estudios. Por ejemplo, Poorter y Bongers (2006) 24 informaron de una estrecha relación entre g S y rasgos representadas por la LES, por ejemplo, con g S disminuye con el aumento de la vida útil de la hoja. En consecuencia, Schulze et al. (1994) 1 demonstvínculos claros nominales entre el contenido de nitrógeno foliar y g SMAX. Del mismo modo, Juhrbandt et al. (2004) 25 encontraron relaciones significativas entre g SMAX y el área foliar y la hoja de nitrógeno contenido. Nuestra segunda hipótesis de diferencias claras con respecto a la hoja de hábito no pudo ser confirmada. La alta variación en los parámetros y características medidas dentro de hoja perenne y de hoja caduca hábito hoja indican que la hoja hábito no es un buen descriptor del LES. Brodribb y Holbrook (2005) 26 discuten que las estrategias fisiológicas hábito de la hoja y de la hoja no se pueden conectar, inevitablemente, ya que la variación amplia rasgo es común en todos los tipos de hoja hábito. El enfoque se puede extender a los rasgos y las características fisiológicas de los órganos de la planta que no sean hojas, por ejemplo, a los rasgos relacionados con la hidráulica del xilema como xilema específica conductividad hidráulica y madera microscopía rasgos de 27. Del mismo modo, otrotipos de rasgos de la hoja que se deriven de la microscopía como la estructura de parénquima en empalizada y la estructura de capa de cera epicuticular podrían incluirse 28. En resumen, este estudio confirma la estrecha relación entre el LES y la regulación de los estomas. Además, el método presentado aquí reveló facetas de patrones de regulación de estomas que no están relacionados con el LES. Especialmente rasgos específicos de la hoja tales como el tamaño de los estomas, densidad y el índice así como la longitud de la vena futuro merecen atención en los estudios de plantas funcionales.

Para avanzar en la comprensión funcional de hojas de las plantas, muchos estudios recientes han intentado relacionar morfológicos, anatómicos y los rasgos de la hoja química a las respuestas fisiológicas, como la conductancia estomática (g S) 4.1. Además, a los rasgos de la hoja, la conductancia estomática se ve fuertemente afectado por las condiciones ambientales, como la densidad de flujo de fotones fotosintéticamente activa, temperatura del aire y vpd 5. Se han propuesto diversas formas de Modelo GS - VPD 6-8 curvas que se basan principalmente en la regresión lineal de gs en ​​VPD 6. En contraste, el modelo presentado en este estudio retrocede los logits de conductancia estomática relativa (es decir, la proporción de g S a la conductancia máxima g estomas SMAX) en vpd y representa la no linealidad añadiendo vpd como término regresor cuadrática. En comparación con otros modelos, el nuevo modelo permite derivar parámetros que describenel vpd a la que g S es el regulado en virtud de la escasez de agua. Del mismo modo, se obtiene el VPD en la que g S es máxima. Como se puede esperar que este tipo de parámetros fisiológicos estar estrechamente vinculada a la asimilación de carbono 9,10 una estrecha relación entre estos parámetros del modelo y las características de la hoja clave para la asignación de los nutrientes y los recursos que se reflejan en el LES se debe esperar 3,11. En consecuencia, debe haber también una estrecha relación entre las estrategias de regulación estomática con rasgos LES. Se espera que tal una relación, en particular, para la hoja de hábito (de hoja perenne contra caducifolio) como hoja hábito está tanto en correlación con el LES y con un uso eficiente del agua 12,13. Especies de hoja perenne tienden a crecer más lentamente, pero son más eficientes en ambientes pobres en nutrientes 14. Por lo tanto, hoja hábito debería traducirse en diferentes patrones de regulación de los estomas, con una estrategia de uso del agua más conservadoras que las especies de hoja caduca. Comparación un gran conjunto de especies de árboles de hoja ancha en una situación jardín común, las siguientes hipótesis fueron probadas: 1) Los parámetros del modelo de g S - modelos VPD están conectados a los rasgos foliares relacionadas con el espectro de la hoja de la economía. 2) especies de hoja perenne tienen valores promedio más baja g S y g SMAX que las especies de hoja caduca.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SC 1 Porometer</td>
			<td>Decagon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any other porometer is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable ties to mark leaves</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic sample bags</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper sample bags</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygrometer</td>
			<td>Trotec</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any other is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axioskop 2 plus</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any other is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% NaOH</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% KOH</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% H2O2</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malachite green</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranine</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

relating stomatal conductance to leaf functional traits

Rasgos funcionales de la hoja son importantes porque reflejan las funciones fisiológicas, como la transpiración y asimilación de carbono. En particular, las características morfológicas de las hojas tienen el potencial para resumir las estrategias de las plantas en términos de eficiencia del uso del agua, el patrón de crecimiento y uso de los nutrientes. El espectro de la hoja de la economía (LES) es un marco reconocido en ecología vegetal funcional y refleja un gradiente de aumentar la superficie específica de la hoja (SLA), hoja de nitrógeno, fósforo y contenido de cationes, y la disminución de la hoja de contenido de materia seca (CMSH) y la relación de nitrógeno de carbono ( CN). El LES se describen diferentes estrategias que van desde la de las hojas de vida corta con alta capacidad fotosintética por masa de hojas de hojas de larga vida con bajas tasas de asimilación de carbono a base de masa. Sin embargo, los rasgos que no están incluidos en el LES pueden proporcionar información adicional sobre la fisiología de la especie, como los relacionados con el control de los estomas. Protocolos se presentan para una amplia gama de hoja functiorasgos nales, incluyendo rasgos de la LES, sino también rasgos que son independientes de la LES. En particular, un nuevo método se introduce que relaciona el comportamiento de regulación de las plantas en la conductancia estomática a déficit de presión de vapor. Los parámetros resultantes de la regulación de los estomas a continuación, se pueden comparar con el LES y otras características funcionales de plantas. Los resultados muestran que los rasgos de hojas funcionales de la LES también fueron predictores válidos para los parámetros de la regulación de los estomas. Por ejemplo, la concentración de la hoja de carbono estaba positivamente relacionado con el déficit de presión de vapor (DPV) en el punto de inflexión y el máximo de la curva de la conductancia vpd. Sin embargo, los rasgos que no están incluidos en el LES añaden información en la explicación de los parámetros de control de los estomas: la vpd en el punto de inflexión de la curva de la conductancia vpd fue menor para las especies con mayor densidad de estomas y más alto índice de estomas. En general, los estomas y la vena rasgos fueron predictores más potentes para explicar la regulación de los estomas trasgos de han utilizado en el LES.

Se encontraron muchos parámetros de la conductancia estomática y la regulación de los estomas estar relacionado con morfológica, anatómica y rasgos químicos de las hojas. En lo que sigue, la atención se centrará en los enlaces para VPD en el punto de inflexión, que disminuyó con la densidad de los estomas (p = 0,04) y el índice de estomas (p = 0,03) y aumentó con el contenido de la hoja de carbono (p = 0,02, Ver Figura 3). Los resultados muestran que con la disminución de VPD en el punto de inflexión se produjo una disminución en la densidad de los estomas y el índice de estomas. Por el contrario, ningún parámetro de conductancia estomática mostró una clara relación con la hoja de hábito. La alta variación dentro de los dos grupos de la hoja hábito muestra que existen diferentes mecanismos de regulación, tanto dentro del grupo de hoja perenne y hábitos de hojas caducas. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52738/52738fig3highres.jpg" width="700" /> Figura Figura 3. Resultado ªE enlaces entre los patrones de regulación de la conductancia y de la hoja rasgos estomas déficit de presión de vapor (VPD) en el punto de inflexión de la S g -. curva de VPD (VpdPoi) como una función de (A) la densidad de estomas, (B) índice de estomas, y contenido de carbono (C) de la hoja 20. Vuelva a imprimir con permiso de 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52738/52738fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Relating Stomatal Conductance to Leaf Functional Traits

Desentrañar cómo se vinculan la fisiología y morfología permite una comprensión más profunda del funcionamiento mecanicista de hojas de la planta. Se presenta tanto un procedimiento para derivar los parámetros de la regulación de los estomas de las mediciones de la conductancia estomática y correlaciones con rasgos tradicionales de hojas funcionales.

Relacionar estomática conductancia de la hoja Rasgos funcionales

Leaf functional traits are important because they reflect physiological functions, such as transpiration and carbon assimilation. In particular, ...

relating-stomatal-conductance-to-leaf-functional-traits

Research

JoVE Journal

Biology

18.9K vistas.  Martin-Luther-University Halle-Wittenberg.  Desentrañar cómo se vinculan la fisiología y morfología permite una comprensión más profunda del funcionamiento mecanicista de hojas de la planta. Se presenta tanto un procedimiento para derivar los parámetros de la regulación de los estomas de las mediciones de la conductancia estomática y correlaciones con rasgos tradicionales de hojas funcionales. 

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Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expresión y purificación de la proteína transmembrana de la fibrosis quística regulador de la conductancia en la Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Investigación

Biología

Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method (EFM)

Water is a key resource, and the plant water transport system sets limits on maximum growth and drought tolerance. When plants open their stomata to achieve a high stomatal conductance (gs) to capture CO2 for photosynthesis, water is lost by transpiration1,2. Water evaporating from the airspaces is replaced from cell walls, in turn drawing water from the xylem of leaf veins, in turn drawing from xylem in the stems and roots. As water is pulled through the system, it experiences hydraulic resistance, creating tension throughout the system and a low leaf water potential (&Psi;leaf). The leaf itself is a critical bottleneck in the whole plant system, accounting for on average 30% of the plant hydraulic resistance3. Leaf hydraulic conductance (Kleaf = 1/ leaf hydraulic resistance) is the ratio of the water flow rate to the water potential gradient across the leaf, and summarizes the behavior of a complex system: water moves through the petiole and through several orders of veins, exits into the bundle sheath and passes through or around mesophyll cells before evaporating into the airspace and being transpired from the stomata. Kleaf is of strong interest as an important physiological trait to compare species, quantifying the effectiveness of the leaf structure and physiology for water transport, and a key variable to investigate for its relationship to variation in structure (e.g., in leaf venation architecture) and its impacts on photosynthetic gas exchange. Further, Kleaf responds strongly to the internal and external leaf environment3. Kleaf can increase dramatically with irradiance apparently due to changes in the expression and activation of aquaporins, the proteins involved in water transport through membranes4, and Kleaf declines strongly during drought, due to cavitation and/or collapse of xylem conduits, and/or loss of permeability in the extra-xylem tissues due to mesophyll and bundle sheath cell shrinkage or aquaporin deactivation5-10. Because Kleaf can constrain gs and photosynthetic rate across species in well watered conditions and during drought, and thus limit whole-plant performance they may possibly determine species distributions especially as droughts increase in frequency and severity11-14.
We present a simple method for simultaneous determination of Kleaf and gs on excised leaves. A transpiring leaf is connected by its petiole to tubing running to a water source on a balance. The loss of water from the balance is recorded to calculate the flow rate through the leaf. When steady state transpiration (E, mmol &bull; m-2 &bull; s-1) is reached, gs is determined by dividing by vapor pressure deficit, and Kleaf by dividing by the water potential driving force determined using a pressure chamber (Kleaf= E /- &Delta;&psi;leaf, MPa)15.
This method can be used to assess Kleaf responses to different irradiances and the vulnerability of Kleaf to dehydration14,16,17.

Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method EFM

We describe a relatively rapid (30 min) and realistic method for simultaneously measurement of leaf hydraulic conductance (Kleaf) and stomatal conductance (gs) for transpiring excised leaves. The method can be modified to measure the light and dehydration responses of Kleaf and gs.

Medición de conductancia de la hoja hidráulica y la conductancia estomática y sus respuestas a la irradiación y la deshidratación mediante el método de evaporación Flux (EFM)

Water is a key resource, and the plant water transport system sets limits on maximum growth and drought tolerance. When plants open their stomata to ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

La purificación de la fibrosis quística regulador de conductancia transmembrana de proteínas expresadas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular systolic and diastolic function. Measures of ventricular contractility and compliance are obtained through examination of cardiac response to changes in afterload and preload. These techniques were originally developed nearly three decades ago to measure cardiac function in large mammals and humans. The application of these analyses to small mammals, such as mice, has been accomplished through the optimization of microsurgical techniques and creation of conductance catheters. Conductance catheters allow for estimation of the blood pool by exploiting the relationship between electrical conductance and volume. When properly performed, these techniques allow for testing of cardiac function in genetic mutant mouse models or in drug treatment studies. The accuracy and precision of these studies are dependent on careful attention to the calibration of instruments, systematic conduct of hemodynamic measurements and data analyses. We will review the methods of conducting pressure-volume loop experiments using a conductance catheter in mice.

Cardiac pressure-volume loop analysis is the most comprehensive way to measure cardiac function in the intact heart. We describe a technique to perform and analyze cardiac pressure volume loops, using conductance catheters.

Cardiaca Presión-Volumen Análisis Loop Utilizando conductancia catéteres en ratones

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular ...

Collection and Long-Term Maintenance of Leaf-Cutting Ants (Atta) in Laboratory Conditions

Ants are one of the most biodiverse groups of animals on the planet and inhabit different environments. The maintenance of ant colonies in controlled environments enables an enriched comprehension of their biology that can contribute to applied research. This practice is usually employed in population control studies of species that cause economic loss, such as Atta ants. To cultivate their mutualistic fungus, these leaf-cutting ants collect leaves and for this are considered agricultural pests widely distributed throughout the American continent. They are highly socially organized and inhabit elaborated underground nests composed of a variety of chambers. Their maintenance in a controlled environment depends on a daily routine of several procedures and frequent care that are described here. It starts with the collection of queens during the reproductive season (i.e., nuptial flight), which are then individually transferred to plastic containers. Due to the high mortality rate of queens, a second collection can be carried out about 6 months after the nuptial flight, when incipient nests with developed fungus wad are excavated, hand-picked, and placed in plastic containers. In the laboratory, leaves are daily provided to established colonies, and ant-produced waste is weekly removed along with remaining dry plant material. As the fungus garden keeps growing, colonies are transferred to different types of containers according to the experimental purpose. Leaf-cutting ant colonies are placed in interconnected containers, representing the organizational system with functional chambers built by those insects in nature. This setup is ideal to monitor factors such as waste amount, fungus garden health, and the behavior of workers and queen. Facilitated data collection and more detailed observations are considered the greatest advantage of keeping ant colonies in controlled conditions.

Collection and Long-Term Maintenance of Leaf-Cutting Ants Atta in Laboratory Conditions

Here, a protocol is described to successfully collect and maintain healthy Atta (Hymenoptera: Formicidae) ant colonies in laboratory conditions. Additionally, different nest types and configurations are detailed together with possible experimental procedures.

Recolección y mantenimiento a largo plazo de hormigas cortadoras de hojas (Atta) en condiciones de laboratorio

Ants are one of the most biodiverse groups of animals on the planet and inhabit different environments. The maintenance of ant colonies in controlled ...

Identification of the Genes Involved in Stomatal Development via Epidermal Phenotype Scoring

Stomata are small pores on the surface of land plants that are involved in gas exchange and water vapor release, and their function is critical for plant productivity and survival. As such, understanding the mechanisms by which stomata develop and pattern has tremendous agronomic value. This paper describes two phenotypic methods using Arabidopsis cotyledons that can be used to characterize the genes controlling stomatal development and patterning. Presented first are procedures for analyzing the stomatal phenotypes using toluidine blue O-stained cotyledons. This method is fast and reliable and does not require the use of epidermal peels, which are widely used for phenotypic analyses but require specialized training. Due to the presence of multiple cysteine residues, the identification and generation of bioactive EPF peptides that have a role in stomatal development have been challenging. Thus, presented second is a procedure used to identify stomatal ligands and monitor their biological activity by bioassays. The main advantage of this method is that it produces reproducible data relatively easily while reducing the amount of peptide solution and the time required to characterize the role of the peptides in controlling stomatal patterning and development. Overall, these well-designed protocols enhance the efficiency of studying the potential stomatal regulators, including cysteine-rich secretory peptides, which require highly complex structures for their activity.

Identification of the Genes Involved in Stomatal Development via Epidermal Phenotype Scoring

This paper describes two phenotyping methods without the use of epidermal peels to characterize the genes controlling stomatal development. The first method demonstrates how to analyze a stomatal phenotype using a toluidine blue O-stained plant epidermis. The second method describes how to identify stomatal ligands and monitor their biological activities.

Identificación de los genes implicados en el desarrollo estomatológico mediante la puntuación del fenotipo epidérmico

Stomata are small pores on the surface of land plants that are involved in gas exchange and water vapor release, and their function is critical for plant ...

A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar tolerance to environmental challenges. An experimental protocol is presented for setting up the hydroponic system, plantlet growth, RSA spreading, and imaging. The approach used a magenta box-based hydroponic system containing polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. Experimental settings are exemplified by assessing the RSA of the plantlets under varying nutrient (phosphate [Pi]) supply. The system was established to examine the RSA of Arabidopsis, but it is readily adaptable to study other plants like Medicago sativa (Alfalfa). Arabidopsis thaliana (Col-0) plantlets are used in this investigation as an example to understand the plant RSA. Seeds are surface sterilized by treating ethanol and diluted commercial bleach, and kept at 4 &#176;C for stratification. The seeds are germinated and grown on a liquid half-MS medium on a polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. The plantlets are grown under standard growth conditions for the desired number days, gently picked out from the mesh, and submersed in water-containing agar plates. Each root system of the plantlets is spread gently on the water-filled plate with the help of a round art brush. These Petri plates are photographed or scanned at high resolution to document the RSA traits. The root traits, such as primary root, lateral roots, and branching zone, are measured using the freely available ImageJ software. This study provides techniques for measuring plant root characteristics in controlled environmental settings. We discuss how to (1) grow the plantlets, and collect and spread root samples, (2) obtain pictures of spread RSA samples, (3) capture the images, and (4) use image analysis software to quantify root attributes. The advantage of the present method is the versatile, easy, and efficient measurement of the RSA traits.

We use simple laboratory tools to examine the root system architecture (RSA) of Arabidopsis and Medicago. The plantlets are grown hydroponically over mesh and spread using an art brush to reveal the RSA. Images are taken using scanning or a high-resolution camera, then analyzed with ImageJ to map traits.

Un protocolo simple para mapear los rasgos de arquitectura del sistema radicular de la planta

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar ...

Investigación espacio-temporal de la dinámica de ERL1 mediante imágenes confocales

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane system. This includes the secretory transport of newly synthesized proteins to the cell surface or the outside of the cell, the endocytic transport of extracellular cargoes or plasma membrane components into the cell, and the recycling or shuttling transport of cargoes between the subcellular organelles, etc. Membrane trafficking events are crucial to the development, growth, and environmental adaptation of all eukaryotic cells and, thus, are under stringent regulation. Cell-surface receptor kinases, which perceive ligand signals from the extracellular space, undergo both secretory and endocytic transport. Commonly used approaches to study the membrane trafficking events using a plasma membrane-localized leucine-rich-repeat receptor kinase, ERL1, are described here. The approaches include plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup. To monitor the spatiotemporal regulation of ERL1, this study describes the co-localization analysis between ERL1 and a multi-vesicular body marker protein, RFP-Ara7, the time series analysis of these two proteins, and the z-stack analysis of ERL1-YFP treated with the membrane trafficking inhibitors brefeldin A and wortmannin.

Autor destacado: Métodos basados en imágenes para estudiar los eventos de tráfico de membrana en células de linaje estomática  

Several commonly used methods are introduced here to study the membrane trafficking events of a plasma membrane receptor kinase. This manuscript describes detailed protocols including the plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup.

Métodos basados en imágenes para estudiar los eventos de tráfico de membrana en células de linaje estomática

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...