Esta obra fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones HL44485 y HL28607.

Declaración de Ética: Todos los procedimientos fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional. 1. Fabricación preliminar de Micropipetas, inmovilización y bloqueadores <ol><li> Tire varios tubos capilares de vidrio de borosilicato limpias en un medio con un extractor electrónica ajustado de manera que, cuando se tira, la porción estirada del tubo es de aproximadamente 1 cm de longitud y las dos mitades son algo simétrica. Asegúrese de que el cono es consistente con las dimensiones de la figura 1. Utilice las dos mitades para micropipetas, inmovilización y bloqueadores. <ol><li> Bisel las micropipetas utilizando una muela de aire impulsado 30 con 0,5 micras papel abrasivo bañado con agua. Ajuste el ángulo del soporte de micropipeta de modo que es de aproximadamente 30 grados desde la horizontal. </li><li> Lave y seque las micropipetas mediante succión para extraer la acetona limpia a través de la punta y el eje. Inspeccione las micropipetas (Figura 1A), utilizando un pequeño microscopio vertical con 4 × 40 × y objetivos equipados con un soporte micropipeta pinza y una retícula ocular. </li><li> Seleccione micropipetas con abertura de la punta de aproximadamente 50 micras de largo con un bisel cuya longitud / anchura relación es de entre 3.1 y 3.5 y con un punto fuertemente cónica que ayuda a penetrar en las fibras de colágeno difíciles en el mesenterio. </li><li> Guarde 15-20 micropipetas de ligeramente diferentes tamaños en una caja libre de polvo. </li></ol></li><li> Hacer inmovilización utilizando tubos capilares tirados preparados en el paso 1.1). Mantenga un tubo capilar de vidrio tirado brevemente cerca de una microllama para formar un extremo romo (Figura 1B). Guarde varios en una caja libre de polvo. </li><li> Hacer microoccluders utilizando tubos capilares tirados preparados en el paso 1.1). Mantenga un tubo capilar tirado bajo un microllama y suavemente doblar (usando un adaptador de la tubería, por ejemplo., 23G) la punta fina (unos 4 mm desde la punta) para hacer un ángulo de cerca de 120 grados en el eje ( <strong&gt; Figura 1C). Marca y almacenar varios. </li></ol> 2. Preparación y Cirugía Animal <ol><li> Anestesiar macho (350 a 450 g) o ratas hembra Sprague-Dawley (de 200-300 g) con pentobarbital sódico (80-100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761) a través de inyección subcutánea; proteger el mesenterio al no utilizar la inyección intraperitoneal. </li><li> A lo largo de los procedimientos quirúrgicos y los protocolos experimentales, mantener la anestesia mediante inyecciones suplementarias (30 mg / kg) según sea necesario. Determinar profundidad de la anestesia por pellizco dedo del pie o del reflejo corneal. Después de la terminación del procedimiento experimental, la eutanasia a la rata a través de sobredosis de pentobarbital o inyección intracardiaca de cloruro de potasio saturado bajo anestesia. </li></ol> 3. Preparar Soluciones y eritrocitos para su uso como marcadores de flujo <ol><li> Prepare la solución de los mamíferos de Ringer para superperfundido y la solución de perfusión de control (típicamente ácido mamíferos solución de Ringer que contiene 10 mg / ml grasoalbúmina libre de suero bovino, BSA). <ol><li> Perfundido Filtrar por 0,2 micras filtros de jeringa para eliminar las partículas diminutas que podrían bloquear la punta de la micropipeta; filtrarse en pequeño recipiente limpio. </li></ol></li><li> Preparar los eritrocitos mediante la elaboración de aproximadamente 0,2 ml de sangre de la vena de la cola de la rata anestesiada en una aguja 20G en una pequeña jeringa que contiene 0,05 ml de heparina (1.000 U / ml) y transferir a un tubo de centrífuga de 15 ml que contiene aproximadamente 14 ml solución de mamífero solución de Ringer . <ol><li> Centrífuga para empacar suavemente las células rojas (sobre un máximo de 200 × g durante 7 min). Dibuja el sobrenadante y volver a suspender las células rojas en la solución de Ringer. </li><li> Después de la centrifugación y eliminación del sobrenadante tres veces salen de los glóbulos rojos concentrados en la parte inferior del tubo para su uso posterior. Tenga en cuenta que este procedimiento reduce las plaquetas en los perfundidos finales a menos de 0,1% de los niveles normales 31. </li></ol></li></ol> 4. Disponer de Tejidos en el AnimalBandeja <ol><li> Afeitarse el abdomen de la rata anestesiada desde abajo del ombligo al apéndice xifoides. Asegúrese de que el área afeitada se extiende alrededor de la parte derecha (por rata colocada en el lado derecho) para que el pelo no se forma una mecha para dibujar el superperfundido fuera del tejido también. Eliminar pelos cortados con una gasa humedecida o tejido. <ol><li> Mantenga la piel con un objeto contundente fórceps dentadas y hacer una incisión en la línea central (2-3 cm de largo) a través de la piel con unas tijeras resistentes. El uso de un bien (iris) tijeras hacen una incisión similar a través de la línea alba, el levantamiento de la pared abdominal con pinzas dentadas para evitar daños en el intestino. </li><li> Con el animal en su lado de la bandeja de animal, tire suavemente de la tripa de la cavidad abdominal con bastoncillos de algodón (palo de madera) empapados en solución de Ringer y pinzas dentadas contundentes. Organizar el intestino en el tejido bien para que el mesenterio se monta sobre el pilar para ver a través del microscopio con cuidado de no tocar el mesenterio (potedañar ntially microvasos), ya sea con fórceps o algodón. Nota: La bandeja de animales (Figura 2A) puede construirse a partir de plexiglás y requiere un tejido bien (alrededor de 3 mm de profundidad), un pilar ópticamente claro (por ejemplo, cuarzo pulido alrededor de 2 cm de diámetro y 5 mm de altura.), Y una almohadilla de calentamiento ajustada para mantener la temperatura del animal. El espesor de la columna no debe exceder la distancia de trabajo del objetivo. </li></ol></li><li> Coloque la bandeja de animal en la platina del microscopio de manera que el mesenterio es visible a través de los oculares. </li><li> Coloque una línea de goteo por gravedad a superfuse continuamente el mesenterio con solución de mamíferos de Ringer mantenida a 35-37 ° C. Utilice compresas de gasa para mantener el intestino en su lugar, ayudar a retener la humedad y absorber el exceso de solución de Ringer de la superficie. Ajustar el flujo y aspirar el efluente para mantener un espesor superperfundido consistente. </li><li> Identificar objetivo microvasos venulares, que sonsegmentos no ramificados aguas abajo del flujo convergente, una o dos ramas distales a los verdaderos capilares. Encontrar un buque no ramificado (idealmente, de 600 a 1.000 m de longitud) con el flujo de sangre a paso ligero y libre de células blancas que se pegan en la pared del vaso. </li><li> Coloque la prueba de microvasos en el centro del campo del microscopio y mover el retenedor en su posición cerca del sitio de canulación elegido. </li></ol> 5. Llene Micropipeta y el monte en el soporte <ol><li> Justo antes de la canulación, suspender las células rojas de la perfusión. Añadir 7 l de concentrado de hematíes a 0,5 ml de perfusión en un tubo de ensayo de borosilicato limpio. Nota: hematocritos de 1-3% pueden ser utilizados, pero hematocrito consistente dará lugar a concentraciones de perfundido consistente de cualquier sustancias liberadas de las células rojas. </li><li> Coloque una jeringa de 1 ml con un adaptador de tubería de 23G y PE 50 tubos (5-15 cm de longitud). Dibuje el / mezcla de glóbulos rojos perfundido en la jeringa. Invertir la jeringa para mezclar y expulsar todas las burbujas de la tubería yadaptador. Para aumentar la eficiencia, la tubería en forma de varias jeringas antes del inicio del experimento y mantenerlos en una caja libre de polvo o bolsa de plástico. </li><li> Llene la micropipeta por el avance de la tubería en el extremo grande de la micropipeta hasta que hace tope con la región cónica. Aplicar un empujón rápido suave en el émbolo de la jeringa para llenar la punta de la micropipeta. Nota: Un pequeño arroyo o de gotas deben ser visibles en la punta a la evidencia de llenado completo. </li><li> Retirar el tubo mientras empuja suavemente el émbolo para llenar la parte más ancha del eje micropipeta. Retire las pequeñas burbujas en el gran eje con un movimiento rápido con cuidado el eje micropipeta. Nota: Un procedimiento similar se ha ilustrado 32. </li><li> Coloque la micropipeta en un soporte de pipetas con un puerto lateral que permite una conexión de fluido continuo a un manómetro de agua. Asegúrese de que el titular, que se adjunta a una unidad hidráulica utilizada para controlar muy bien el avance de la micropipeta, se encuentra en un ligero ángulo (15 a 25 °)a la horizontal de modo que el borde de la conicidad micropipeta no golpea el intestino o en la bandeja. </li><li> Monte la unidad hidráulica en un micromanipulador móvil, que tiene x, y, z y unidades para permitir estrecha alineación con el recipiente de ensayo (Figura 2). </li><li> Ajustar la presión hidrostática aplicada al fluido en la micropipeta utilizando una jeringa o pera de goma lleno de agua para cambiar la altura de líquido en la columna de agua del manómetro a aproximadamente 40 cmH 2 O por encima del mesenterio. </li><li> Canular la microvasos tan pronto como sea posible después de llenar la pipeta; células rojos se asientan en la parte inferior de la pipeta, de modo que después de aproximadamente 40 min muy pocas células rojas fluirá al interior del recipiente. </li></ol> 6. Microcannulation y microvascular Medición de Presión <ol><li> Antes de colocar la micropipeta llena bajo el microscopio, presionar suavemente el limitador sobre el tejido cerca de la microvasos aplicar fuerza suficiente para agarrar el tejido. Dibujar elretenedor de la espalda, estirando ligeramente el tejido en línea con el de los microvasos de manera que las tensiones en las fibras de colágeno mesentéricos están alineados con el recipiente. <ol><li> Alinear la micropipeta con el buque y lo baja a la vista a través de los oculares. Coloque la punta justo aguas arriba del sitio de canulación elegido y lo baja sobre el tejido de modo que obstruye parcialmente el flujo dentro del vaso, pero no ocluir la misma. </li></ol></li><li> Canular la embarcación por la conducción de la punta de la pipeta lentamente en la luz del vaso utilizando el accionamiento hidráulico. Tenga cuidado de no empujar a través de la parte inferior del recipiente. Nota: Como la micropipeta entra en el lumen, el perfundido se lava rápidamente la sangre en el recipiente fuera del lumen y perfundido fluye libremente en circulación distal del animal para la prueba de los microvasos, desplazando parte de la perfusión normal de la sangre en los vasos aguas abajo. </li><li> Bajar la presión de perfusión mediante el ajuste del manómetro hasta que la sangre (como se indicapor las células rojas de los animales) se dibuja de nuevo en el segmento de perfusión; esto determina la presión de equilibrio en el que las células rojas oscilan suavemente en la luz del vaso y mide la presión hidrostática de microvasos (P c) en el extremo distal del segmento de microvasos. Mantener la perfusión buque en todas las presiones por encima de esta presión de equilibrio. </li></ol> 7. Microocclusion y Recolección de Datos <ol><li> Paso opcional: Antes de utilizar el micro-oclusor para bloquear el recipiente, pulse en el tejido en una zona no utilizada del mesenterio lejos de cualquier recipiente de modo que la punta se acumula una fina almohadilla de tejido que protege el recipiente experimental durante micro repetida oclusiones. </li><li> Coloque el bloqueador por encima del recipiente de perfundido cerca del borde inferior del campo del microscopio. </li><li> Registre la siguiente con el vídeo y el audio. <ol><li> Verbalmente registrar la ubicación del sitio de bloque y el borde inferior de la pantalla como se ve en la retícula ocular. </li><li> Con la puntadel bloqueador colocado justo encima de la de los microvasos, utilice el control z fina de la micromanipulador para bajar suavemente el bloqueador hasta que se ocluye el flujo en el vaso. Tenga en cuenta la presión del manómetro (Pc) en audio. Aplicar la oclusión normalmente para 3.10 segundos, y luego suelte, la restauración de la perfusión libre. Mueva el sitio de bloque hasta la embarcación hacia la punta de la pipeta en 5-10 micras pasos basados ​​en tiempo (&gt; 5 min después del bloque inicial en un sitio), número de oclusiones (3-5), para evitar daños en la pared del vaso en el sitio de bloque . </li></ol></li></ol> 8. Análisis de datos y medición de Lp (Agua Permeabilidad) <ol><li> Durante la reproducción de vídeo, determinar la distancia inicial (ℓ 0) a partir de una célula roja marcador para el sitio de la oclusión mediante el uso de una imagen de un micrómetro de platina y las posiciones conocidas en las imágenes. Determinar la velocidad inicial (dl / dt) de la célula marcador de su posición en varios marcos durante el 3-10 seg de las imágenes grabadas. Disuadirmina el radio del vaso (r) a partir de las imágenes tomadas durante la oclusión (Figura 3). </li><li> Calcular J v / S para cada oclusión como (dl / dt) × (1 / ℓ 0) x (r / 2). Calcular L p a una presión constante como (J v / S) dividida por la presión de conducción (presión de microvasos - efectiva la presión osmótica coloidal; ver Discusión). </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Los detalles de los cálculos PL. Aunque el movimiento del fluido transvascular ocurre mientras el buque está libremente perfundido, dicho intercambio es demasiado pequeña para ser medida durante la perfusión libre porque es típicamente menos de 0,01% de la tasa de perfusión buque. Sin embargo, cuando la perfusión se detiene transitoriamente mediante la oclusión de la microvasos, el flujo de transvascular (es decir, la filtración) se mide desde el movimiento de las células rojas de ...

Microperfusión en la vasculatura conlleva establecer el flujo de un líquido de perfusión artificial de composición conocida controla a través de una micropipeta en un vaso sanguíneo por lo general menos de 40 micras de diámetro. El recipiente de perfundido se mantiene dentro de su entorno de tejido normal y es perfundido con la sangre del animal hasta el momento de la canulación. Cuando se utiliza junto con una serie de imágenes de vídeo o técnicas fluorométricos, en microperfusión situ permite la medición de los flujos de agua y de solutos a través de las paredes de los microvasos en condiciones donde se sabe que las fuerzas de conducción para estos flujos y las propiedades de permeabilidad de la pared vascular pueden ser directamente evaluado. Además, mediante el control de la composición del líquido que rodea al de los microvasos en el tejido (perfundido y superperfundido), la regulación de la permeabilidad microvascular y el intercambio se puede investigar al permitir que las células endoteliales que forman la pared de los microvasos de estar expuestos a una variedad de correocondiciones Xperimental (agonistas, condiciones de perfusión modificados, indicadores fluorescentes para medir la composición intracelular y la señalización) durante períodos medidos con precisión de tiempo (seg a hr). Además, las evaluaciones ultraestructurales o citoquímicos de estructuras moleculares celulares clave que regulan la barrera se pueden investigar en los mismos microvasos en el que se mide directamente la permeabilidad. El enfoque de esta manera forma un puente entre la investigación de los mecanismos celulares y moleculares para modificar la función de barrera endotelial en cultivos de monocapas de células endoteliales y la investigación en microvasos intactos. Ver las siguientes revisiones para evaluación adicional 1-6. Una limitación de microperfusión es que sólo se puede utilizar en lechos microvasculares que son delgadas, transparentes y tienen una integridad estructural suficiente para permitir la canulación con una micropipeta de vidrio. Mientras que las primeras investigaciones utilizan microvasos rana en el mesenterio y delgado cutánea angina de muscle 7,8, con mucho, la preparación más comúnmente utilizado en los modelos de mamíferos es el mesenterio de rata 9-15. La mayoría de las investigaciones se han centrado en los cambios agudos en la permeabilidad vascular estudiado durante períodos de 1-4 horas, pero las investigaciones más recientes se han extendido a las mediciones en los buques individuales de 24-72 hr después de una perfusión inicial 12,16. La tecnología CRISPR recientemente desarrollado, que promete hacer modelos de ratas modificadas genéticamente más disponibles para el estudio de la regulación de la permeabilidad vascular 17 debería permitir a los métodos descritos en esta comunicación que se aplicarán en los microvasos venulares del mesenterio en estos importantes nuevos modelos de rata. El método requiere un microscopio invertido equipado con una platina del microscopio a la medida lo suficientemente grande como para contener tanto la preparación de los animales y al menos tres micromanipuladores utilizado para microherramientas posición cerca de la embarcación perfundido y para alinear una micropipeta perfusión con el buquelumen. Por ejemplo, una plataforma personalizada para una platina del microscopio xy (alrededor de 90 × 60 cm) puede fabricarse a partir de una placa de acero 1 cm de espesor con un revestimiento a prueba de herrumbre. La etapa está unido a una tabla de índices de ingeniería o dos diapositivas en cola de milano montados en ángulos rectos y apoyadas sobre pilares de teflón o transferencias de bolas para el movimiento en el plano horizontal. Una plataforma típica (véase la figura 2) tiene mucho en común con el equipo de microscopio y microposicionamiento utilizado para una serie de experimentos microcirculación intravital como los que para medir el flujo único de los vasos sanguíneos y el hematocrito, el suministro de oxígeno local microvasos sanguíneos perfundidos, la regulación de liso vascular el tono muscular y la acumulación microvascular local de los trazadores fluorescentes inyectados en toda la circulación. 18-26 El aspecto fundamental de la técnica es la medición del flujo de volumen (v J) a través de un área de superficie definida (S) de la pared de los microvasos. Para llevar a caboesto a través de la técnica de Landis modificado descrito en el presente documento un sencillo microscopio invertido es adecuada. Una cámara de video pequeña está montado en el puerto de imagen y la señal de vídeo, con una base de tiempo de descuento, se visualiza en un monitor de video y grabado, ya sea en forma digital en un ordenador o como una señal digital o analógica en una grabadora de vídeo. Una vez que el microvasos se canula la porción de la microvasos visible a la cámara se puede cambiar moviendo el escenario y manipuladores como una unidad sin alterar la canulación. Medición de los flujos de transvascular también se puede combinar con las investigaciones más detalladas utilizando un microscopio de fluorescencia sofisticado con filtros adecuados tales como equipos de perforación utilizados para las mediciones de permeabilidad soluto, monitoreo relación fluorescente de calcio citoplasmático u otros mecanismos celulares, y de formación de imágenes confocal 6,12,13, 27. Una ventaja clave de todos los enfoques microperfusión es la capacidad de tomar medidas repetidas, en el mismo buque, En la variación controlada de fuerza motriz, como presiones hidrostáticas y oncóticos o cambio inducido en las respuestas de los buques a las condiciones inflamatorias. El diseño más común es una comparación emparejada de la conductividad hidráulica medida (L p) en el mismo recipiente con el recipiente primero perfundido a través de una micropipeta llena de un líquido de perfusión de control y la suspensión de glóbulos rojos para establecer un estado permeabilidad línea de base, a continuación, con una segunda pipeta con el agente de prueba añadido al perfundido. Múltiples canulaciones son posibles con el ciclo se repite después de la reperfusión con la pipeta de control. El presente protocolo demuestra la canulación y microperfusión de un vaso venular en mesenterio de rata para grabar flujos de agua a través de la pared de microvasos y medir la L p de la pared del vaso, un índice útil de la permeabilidad de la vía común para el agua y solutos a través de la intacto barrera endotelial. El procedimiento se denomina techniq Landis modificadoue porque el principio Landis original de utilizar el movimiento relativo de los glóbulos rojos como una medida de intercambio de fluido transvascular después de la perfusión está bloqueado se conserva 28, pero la gama de condiciones experimentales (por ejemplo, las diferencias de la presión oncótica hidrostáticas y de albúmina a través de la pared de los microvasos) disponible después microperfusión es mucho mayor que en la sangre perfundida microvasos uncannulated 8,29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MICROSCOPE, TABLE AND STAGE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK-40</td>
			<td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL</td>
			<td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>narrow diameter, long working distance objective: example</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon E Plan 10&#215;/0.25 LWD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel</td>
			<td>welding shop</td>
			<td></td>
			<td>this should be heavy to reduce vibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unislide x-y table: dove tail slides</td>
			<td>Velmex</td>
			<td>AXY4006W1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIDEO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD video camera: example</td>
			<td>Pulnix</td>
			<td>TM-7CN (no longer available)</td>
			<td>no color needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>video capture system with audio--generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>video playback system (completely still frame, single frame motion)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small microphone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROMANIPULATORS, HOLDERS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator, XYZ (3)</td>
			<td>Prior/Stoelting (no longer available)</td>
			<td></td>
			<td>look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydraulic probe drive, one way</td>
			<td>FHC</td>
			<td>50-12-1C</td>
			<td>need to buy either manual drive or electronic drive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manual drum drive&#160;</td>
			<td>FHC</td>
			<td>50-12-9-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>or hydraulic drive, 3 way</td>
			<td>Siskiyou Corporation</td>
			<td>MX610 (1-way) or MX630 (3-way)</td>
			<td>great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>connectors/rods/holders</td>
			<td>Siskiyou Corporation</td>
			<td>MXC-2.5, MXB etc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pin vise</td>
			<td>Starrett</td>
			<td>162C</td>
			<td>to hold restrainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette holder</td>
			<td>World Prescision Instruments</td>
			<td>MPH3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water manometer ~120 cm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROSCOPE TRAY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clear Plexiglas for microscope tray for animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall</td>
			<td>Quartz Scientific Inc.</td>
			<td>custom</td>
			<td>&#160;(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medical adhesive for tissue well</td>
			<td>NuSil</td>
			<td>MED-1037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-purpose silicone rubber heat mat, 5&#34; L x 2&#34; W</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-03125-20</td>
			<td>heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-03122-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-01575-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET MANUFACTURE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vertical pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-30 with nichrome filament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm OD thin wall capillary tubing</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>B150-110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RX Honing Machine, System II</td>
			<td>RX Honing Machine Corporation</td>
			<td>MAC-10700 Rx System II Machine</td>
			<td>alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; with ceramic sharpening disc</td>
			<td>RX Honing Machine Corporation</td>
			<td></td>
			<td>use &#34;as is&#34; or attach lapping film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um</td>
			<td>3M</td>
			<td>part no. 051144 80827</td>
			<td>268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microperfusion technique to investigate regulation of microvessel permeability in rat mesentery

Experimentos para medir las propiedades de permeabilidad de microvasos perfundidos individualmente proporcionan un puente entre la investigación de los mecanismos moleculares y celulares que regulan la permeabilidad vascular en cultivos de monocapas de células endoteliales y las propiedades de intercambio funcionales de camas microvasculares enteros. Un método para canular y perfundir microvasos venulares de mesenterio de rata y medir la conductividad hidráulica de la pared de microvasos se describe. El equipo principal necesaria incluye un microscopio intravital con una etapa modificado grande que soporta micromanipuladores para posicionar tres Microtools diferentes: (1) una micropipeta de cristal biselado para canular y perfundir el microvasos; (2) un micro-oclusor de vidrio para bloquear transitoriamente la perfusión y permitir la medición de movimiento de circulación de agua transvascular a una presión hidrostática medido, y (3) una varilla de vidrio contundente para estabilizar el tejido mesentérico en el sitio de canulación. El Landis micro-oclusión techniq modificadoue utiliza glóbulos rojos suspendidos en el líquido de perfusión artificial como marcadores de movimiento de fluidos transvascular, y también permite mediciones repetidas de estos flujos condiciones experimentales se cambian y la diferencia de presión osmótica hidrostática y coloidal a través de los microvasos se controlan cuidadosamente. Las mediciones de la conductividad hidráulica primero utilizando un perfundido control, a continuación, después de volver a la canulación de la misma con los microvasos perfundidos de prueba permitir comparaciones de la respuesta de los microvasos bajo estas condiciones bien controladas emparejados. Los intentos de extender el método a los microvasos en el mesenterio de ratones con modificaciones genéticas esperados para modificar la permeabilidad vascular fueron severamente limitadas debido a la ausencia de largas microvasos rectas y no ramificados en el mesenterio ratón, pero la reciente disponibilidad de las ratas con modificaciones genéticas similares utilizando Se espera que la tecnología / Cas9 CRISPR para abrir nuevas áreas de investigación en que los métodos descritos en el presente documento pueden aplicarse. </p&gt;

La Figura 4 muestra los resultados de la medición de la evolución temporal de los cambios en L p en una rata venular microvasos canulado sucesivamente con cuatro perfundidos. 33 La magnitud de L p calculado a una presión constante se usó como una medida de los cambios en la permeabilidad de la pared de los microvasos, primero en el estado de control con un líquido de perfusión que contiene 1% de albúmina de suero bovino a continuación, cuando el recipiente se exp...

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Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusión Técnica de investigar Reglamento de Microvessel Permeabilidad en Rata Mesenterio

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

microperfusion-technique-to-investigate-regulation-microvessel

Research

JoVE Journal

Biology

9.6K vistas.  University of California Davis. The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions. 

Video: Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

Preparación de 2-dGuo cultivos tratados con órganos timo

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Investigación

Biología

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

Rata mesenterio ensayo angiogénesis

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

La Ex vivo Preparación aislada Microvessel esquelético para la Investigación de la reactividad vascular

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

Rata Exteriorización Mesenterio: un modelo para investigar la dinámica celulares implicados en la angiogénesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

El aislamiento de los ribosomas polipéptidos nacientes Bound<em&gt; In vitro</em&gt; Para la identificación de sitios de traslación pausa a lo largo del ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Usar secuencias de detención SecM como una herramienta para aislar Ribosome polipéptidos enlazados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

La cuantificación individual Microvessel Permeabilidad en aislado de rata Blood-perfundido Preparación de pulmón

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Medición de la osmótica de agua Coeficiente de Permeabilidad (P<sub&gt; F</sub&gt;) De células esféricas: protoplastos de plantas aisladas como ejemplo

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.