Financiamiento: este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias de China (32270538), el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2022YFF0710603), la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (6222046) y el financiamiento estratégico CAS a través del esquema de financiamiento CAS-CSIRO (152111KYSB20210011) otorgado a G.H.W. Contribuciones del autor: todos los autores desarrollaron el alcance y el enfoque de la revisión y contribuyeron a la redacción del manuscrito.

1. Preparación de medio de cría deNasonia libre de gérmenes 
<ol><li>Coloque las pupas de L. sericata disponibles comercialmente (consulte la Tabla de materiales) en una superficie que pueda acomodar todas las pupas, como una bandeja o una hoja de papel. Deseche cualquier larva subdesarrollada, pupas viejas oscuras, conchas de pupa vacías, aserrín u otras impurezas. Mantenga solo pupas jóvenes que sean de color rojo parduzco y transfiéralas a un vaso de precipitados (aproximadamente 3,000-4,000 pupas). NOTA: Después de realizar muchos experimentos, se descubrió que el medio hecho de las pupas viejas oscuras se oscurecía fácilmente y detenía el desarrollo de avispas libres de gérmenes. Este fenómeno no ocurrió cuando se usaron las pupas jóvenes de color marrón rojizo para producir medio. La razón de esto aún no está clara y requiere más investigación para verificarlo.</li>
	<li>Agregue suficiente agua desionizada al vaso de precipitados para cubrir toda la superficie de las pupas. Envuelva la boca del vaso de precipitados con papel de aluminio o gasa, agite el vaso de precipitados para limpiar las impurezas en la superficie de las pupas y luego vierta el agua. Repita de tres a cinco veces.</li>
	<li>Coloque las pupas limpias de L. sericata en el tanque de filtro de una prensa de ajo, apriete con fuerza y recoja el líquido tisular de las pupas de L. sericata en un tubo de centrífuga estéril de 50 ml . Luego, vierta las heces de pupa y ponga pupas nuevas en el tanque de filtro de la prensa de ajo hasta que todas estén exprimidas. NOTA: En comparación con el dispositivo de extrusión de agujas utilizado por Wang et al.14, la prensa de ajo es más conveniente y puede separar el líquido intersticial más a fondo. Este avance sienta las bases para la producción a gran escala y el almacenamiento a largo plazo de NRM.</li>
	<li>Centrifugar la mezcla a 4 °C (25.000 x g) durante 10 min. Después de la centrifugación, la mezcla se separará en tres capas de abajo hacia arriba: capa de sedimento, capa de proteína y capa de grasa (Figura 1).</li>
	<li>Para evitar obstrucciones durante la filtración, aspire la capa de proteína con una aguja estéril de 18 G y transfiérala a un nuevo tubo centrífugo de polipropileno estéril cónico de 50 ml.</li>
	<li>Agregue el medio líquido comercial de Drosophila (consulte la Tabla de materiales) al extracto de proteína en una proporción de 1: 1. NOTA: Se utilizó L. sericata comercializada más conveniente como materia prima huésped y NRM, en comparación con NRMv3. Por lo tanto, la relación nutricional se ajustó de 1:2 a 1:1 en base a NRMv3, que fue más adecuada para el crecimiento y desarrollo de Nasonia estéril (Figura 2).</li>
	<li>Filtrar el medio mixto (medio de Drosophila y extracto proteico de L. sericata pupa) utilizando un sistema de filtración al vacío con diferentes tamaños de poro (8, 1.2, 0.8 y 0.45 μm; ver Tabla de materiales) para eliminar partículas de diferentes tamaños. Para evitar obstrucciones, cambie el papel de filtro cuando el flujo disminuya. NOTA: Se requiere el uso de un nuevo tubo centrífugo estéril de 50 ml para cada filtración.</li>
	<li>Centrifugar de nuevo el líquido a 4 °C (15.000 x g) durante 10 min y esterilizar el medio sobrenadante a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm. Repita los pasos anteriores una vez.</li>
	<li>Conservar el medio de cultivo a -20 °C después de la alícuota (figura 3A) para su almacenamiento a largo plazo. NOTA: Para evitar la contaminación y la congelación y descongelación repetidas, se recomienda abrir cada tubo de MRN solo una vez cuando se use el medio de cultivo después del envasado (Figura 3A).</li>
</ol>2. Recolección de huevos libres de gérmenes
<ol><li>Para asegurar una proporción estable macho-hembra en la descendencia, coloque las pupas en un vial de Drosophila durante la etapa pupal en una proporción de 50 hembras a 15 machos debido a sus características genéticas haploides (los machos se desarrollan a partir de células haploides, mientras que las hembras se desarrollan a partir de células diploides que resultan de huevos fertilizados)4,15.<ol><li>Después de emerger a adultos, permita que los machos y las hembras se apareen durante 1,5 días, y luego ponga aproximadamente 40 pupas de L. sericata en el vial. Dentro de las 12-24 h después de la parasitación, use una aguja de disección estéril para abrir cuidadosamente un extremo de la cáscara de la pupa bajo un microscopio estereoscópico (Figura 4).</li>
		<li>Sostenga el otro extremo con la mano y encuentre los embriones de avispa. Utilice una aguja de disección para transferir embriones de la superficie del tejido de L. sericata pupa a un colador de células estéril con solución salina tamponada con fosfato (PBS)14. NOTA: Las pupas más viejas de L. sericata deben usarse para el parasitismo porque el tejido seco de L. sericata pupa es más fácil de transferir embriones . Para garantizar la transferencia suave de los huevos desde la superficie del tejido de L. sericata pupa, trate de tener cuidado de no perforar el tejido cuando la aguja de disección abra la caja de la pupa para que el líquido intersticial no fluya.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque 20-30 embriones en un filtro celular y lávelos uniformemente con 1,000 μL de solución comercial de hipoclorito de sodio al 10% (consulte la Tabla de materiales), seguido de otro lavado con 1,000 μL de PBS estéril 1x. Luego, lavar una vez con 1,000 μL de solución de etanol al 70% y lavar tres veces con 1,000 μL de 1x PBS estéril.</li>
	<li>Primero, coloque una lámina de malla de polipropileno de 5 mm de diámetro (consulte la Tabla de materiales) que haya sido prehumedecida con 1x PBS en una placa de 24 pocillos. Luego, usando un cepillo pequeño esterilizado, cepille suavemente los embriones de avispa en el colador celular sobre la lámina de malla de polipropileno. Esto se puede hacer para los cuatro pozos en una columna vertical de la placa de 24 pocillos.</li>
</ol>3. Cría de avispas libres de gérmenes
<ol><li>Agregue 50 μL de NRM a cada pocillo en una campana de flujo laminar. Para mantener un ambiente húmedo para el crecimiento, agregue 1 ml de agua estéril entre cada pozo en la placa de 24 pocillos. También se puede colocar un vaso pequeño que contiene 30 ml de agua estéril en la caja de plástico estéril de 5 L con la placa de 24 pocillos.<ol><li>Durante todo el experimento, mantenga la caja de plástico estéril y la placa de 24 pocillos en una cámara climática a una temperatura constante de 25 ± 2 °C y bajo luz constante.</li>
	</ol></li>
	<li>Antes de transferir y agregar NRM todos los días, descongele el NRM congelado en un banco de flujo laminar. En un ambiente estéril, use pinzas desinfectadas con alcohol para transferir la malla de polipropileno con larvas de un pozo a otro. Por último, agregue 50 μL de MRN que se haya equilibrado a temperatura ambiente (Figura 3B). Repita las operaciones anteriores todos los días hasta que se observen las pupas. NOTA: Con el desarrollo de avispas, la cantidad de MRN debe aumentarse adecuadamente para garantizar que las avispas libres de gérmenes tengan suficiente nutrición. Por ejemplo, las larvas del cuarto estadio recibieron de 60 a 70 μL de NRM. Dado que diferentes etapas de desarrollo pueden coexistir en el mismo pozo, use un cepillo esterilizado para transferir las pupas. Agregue una pequeña cantidad de MRN a las larvas restantes. Utilizar técnicas asépticas para evitar la invasión microbiana y la contaminación.</li>
	<li>Después de alimentarse durante 9 a 11 días, más del 80% de las larvas se convierten en pupas blancas o amarillas. En este momento, mueva el filtro a una placa de pozo limpio y deje de agregar medio de cultivo para esperar la eclosión.</li>
</ol>

Cría de avispas Nasonia libres de gérmenes

<ol>
	<li>Diviccaro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+impact+of+the+microbiome+on+neuroactive+steroid+levels+in+germ-free+animals.">Exploring the impact of the microbiome on neuroactive steroid levels in germ-free animals.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12551 (2021).</li><li>Pang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-species+transplantation+of+gut+microbiota+from+human+to+pigs.">Inter-species transplantation of gut microbiota from human to pigs.</a> The ISME Journal. 1 (2), 156-162 (2007).</li><li>Uzbay, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-free+animal+experiments+in+the+gut+microbiota+studies.">Germ-free animal experiments in the gut microbiota studies.</a> Current Opinion in Pharmacology. 49, 6-10 (2019).</li><li>Zhu, Z., Liu, Y., Hu, H., Wang, G. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasonia-microbiome+associations:+a+model+for+evolutionary+hologenomics+research.">Nasonia-microbiome associations: a model for evolutionary hologenomics research.</a> Trends in Parasitology. 39 (2), 101-112 (2022).</li><li>Li, J., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+efficient+germ-free+animal+system+to+support+functional+microbiome+research.">Establishment of an efficient germ-free animal system to support functional microbiome research.</a> Science China Life Sciences. 62 (10), 1400-1403 (2019).</li><li>Wang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+microbiome+confer+multigenerational+host+resistance+after+sub-toxic+pesticide+exposure.">Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure.</a> Cell Host Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).</li><li>Wang, G. H., Dittmer, J., Douglas, B., Huang, L., Brucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coadaptation+between+host+genome+and+microbiome+under+long-term+xenobiotic-induced+selection.">Coadaptation between host genome and microbiome under long-term xenobiotic-induced selection.</a> Science Advances. 7 (19), (2021).</li><li>Dittmer, J., Brucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+your+host+shuts+down:+larval+diapause+impacts+host-microbiome+interactions+in+Nasonia+vitripennis.">When your host shuts down: larval diapause impacts host-microbiome interactions in Nasonia vitripennis.</a> Microbiome. 9 (1), 85 (2021).</li><li>Dittmer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+a+holobiont-recent+advances+and+perspectives+in+Nasonia+wasps.">Disentangling a holobiont-recent advances and perspectives in Nasonia wasps.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1478 (2016).</li><li>Brooks, A. W., Kohl, K. D., Brucker, R. M., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylosymbiosis:+relationships+and+functional+effects+of+microbial+communities+across+host+evolutionary+history.">Phylosymbiosis: relationships and functional effects of microbial communities across host evolutionary history.</a> PLoS Biology. 14 (11), e2000225 (2016).</li><li>Heavner, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+venom+gland+transcriptome+of+a+Drosophila+parasitoid+wasp,+Leptopilina+heterotoma,+reveals+novel+and+shared+bioactive+profiles+with+stinging+Hymenoptera.">Partial venom gland transcriptome of a Drosophila parasitoid wasp, Leptopilina heterotoma, reveals novel and shared bioactive profiles with stinging Hymenoptera.</a> Gene. 526 (2), 195-204 (2013).</li><li>Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+the+hymenoptera+genetic+model,+Nasonia.">In vitro cultivation of the hymenoptera genetic model, Nasonia.</a> PLoS One. 7 (12), e51269 (2012).</li><li>Shropshire, J. D., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+approach+to+germ-free+rearing+in+the+jewel+wasp+Nasonia.">An optimized approach to germ-free rearing in the jewel wasp Nasonia.</a> PeerJ. 4, e2316 (2016).</li><li>Wang, G. H., Brucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+Nasonia+germ-free+rearing.">An optimized method for Nasonia germ-free rearing.</a> Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).</li><li>Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hologenomic+basis+of+speciation:+gut+bacteria+cause+hybrid+lethality+in+the+genus+Nasonia.">The hologenomic basis of speciation: gut bacteria cause hybrid lethality in the genus Nasonia.</a> Science. 341 (6146), 667-669 (2013).</li><li>Fontaine, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+free+of+germs+is+germ-free?+Detection+of+bacterial+contamination+in+a+germ+free+mouse+unit.">How free of germs is germ-free? Detection of bacterial contamination in a germ free mouse unit.</a> Gut Microbes. 6 (4), 225-233 (2015).</li><li>Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunomodulatory+molecule+of+symbiotic+bacteria+directs+maturation+of+the+host+immune+system.">An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system.</a> Cell. 122 (1), 107-118 (2005).</li><li>Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+drugs+and+the+gut+microbiome.">Interaction between drugs and the gut microbiome.</a> Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Con la aplicación de tecnologías de detección de alto rendimiento como la genómica y la metabolómica, los investigadores se han dado cuenta gradualmente de que existe una enorme diversidad genética y complejidad metabólica en la microbiota intestinal16. Estas bacterias simbióticas están estrechamente relacionadas con diversos estados fisiológicos o patológicos, como el metabolismo nutricional del huésped, los tumores, la inmunidad y el envejecimiento a través de interacciones compleja...

Los animales libres de gérmenes son animales que no tienen microorganismos vivos detectables ni parásitos1. Los embriones libres de gérmenes pueden obtenerse diseccionando a la madre en condiciones asépticas y posteriormente criados en sistemas de barrera2. Estos animales pueden utilizarse para estudiar los efectos de los microorganismos en los animales, como la microbiota intestinal, el sistema inmunitario y el metabolismo1. Con ciertos medios técnicos, muchos insectos e incluso mamíferos pueden volverse estériles 3,4. Los animales libres de gérmenes tienen un papel único y han sido ampliamente utilizados en diversos aspectos de la investigación microbiológica5. Por ejemplo, el uso de avispas Nasonia libres de gérmenes ha revelado que los microorganismos pueden ayudar a los huéspedes a adaptarse a nuevos ambientes bajo estrés ambiental exógeno a largo plazo 6,7.
Los parasitoides de Nasonia son pequeñas avispas parásitas que inyectan sus huevos en las pupas de las moscas4. Hay cuatro especies conocidas de Nasonia, incluyendo Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti y Nasonia oneida8. N. vitripennis se puede encontrar en todo el mundo, mientras que las otras tres especies tienen rangos limitados en América del Norte4. Las avispas parasitoides Nasonia son consideradas como insectos modelo ideales debido a sus características, como fácil cultivo, ciclo de reproducción corto, genoma secuenciado y diapausa a largo plazo 8,9. Se pueden utilizar para estudiar diversos aspectos de la evolución, la genética, el desarrollo, el comportamiento y la simbiosis de los insectos10. Además, las avispas parasitoides Nasonia también pueden ayudar a controlar las moscas dañinas en la agricultura y las enfermedades11. El establecimiento exitoso de un sistema de insectos estériles implica dos pasos principales: (1) esterilización de los embriones y (2) provisión de alimentos estériles a las larvas in vitro. Para obtener alimentos estériles, Brucker y Bordenstein 12 desarrollaron el medio de cría Nasonia (NRMv1) en 2012 mediante el uso de productos químicos como antibióticos, lejía y suero bovino fetal para matar bacterias12. Sin embargo, el método de esterilización química resultó en bajas tasas de supervivencia y eclosión de N. vitripennis13. Luego, en 2016, Shropshire et al. desarrollaron NRMv2 utilizando un método de esterilización por filtro en lugar de un método de esterilización química para eliminar los peligros de los antibióticos y otras sustancias, y optimizaron el proceso de reproducción13. Desafortunadamente, este método todavía tiene algunas desventajas, como los desafíos asociados con la preparación y el uso del medio, así como los riesgos de ahogamiento, subalimentación o deshidratación para los embriones, larvas y pupas cerradas14. Wang y Brucker14 mejoraron recientemente los protocolos de medios de cría Nasonia versión 3 (NRMv3) y la versión 2 de cría libre de gérmenes (GFRv2). Estas mejoras redujeron el costo y el consumo de medios. Sin embargo, el NRMv3 tiene un tiempo de almacenamiento muy corto y es altamente susceptible a la contaminación.
Sobre la base de NRMv3, el método de almacenamiento de la herramienta de preparación de NRM y la proporción de nutrientes se optimizaron en este estudio. Este refinamiento metodológico facilita el uso de N. vitripennis como modelo para estudios de microbiomas. En comparación con el NRMv3 desarrollado por Wang et al.14, la herramienta mejorada para exprimir la pupa Sarcophaga bullata, una de las materias primas del MRN, mejora en gran medida la eficiencia de producción del fluido tisular de S. bullata pupa en comparación con la jeringa de 60 ml con un orificio inferior utilizada por Wang et al.14. Ajustamos la proporción de nutrientes de NRM, lo que condujo a un cierto aumento en la tasa de supervivencia de las avispas Nasonia libres de gérmenes sin afectar su tiempo de desarrollo. Además, el NRM se envasó en tubos de centrífuga de pequeña capacidad (1,5 ml) y se congeló en un refrigerador de -20 ° C para extender el tiempo de almacenamiento. Vale la pena señalar que, si bien utilizamos la mosca doméstica Lucilia sericata como huésped y fuente para la preparación de MRN, este protocolo probablemente se puede adaptar para otros huéspedes de Nasonia que están disponibles en el laboratorio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 Sterile vacuum filter</td>
			<td>NEST</td>
			<td>331011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SodiumHypochlorite</td>
			<td>LIRCON</td>
			<td>XB-84BS-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mesh nylon net</td>
			<td>BIOBYING</td>
			<td>BY-378Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24&#160;well-plate</td>
			<td>NEST</td>
			<td>702001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8, 1.2, 0.8, and 0.45 &#181;m filters</td>
			<td>Shanghai Xingya Purification Material Factory</td>
			<td>HN-AA-JT-10079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethyl alcohol</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>E809057-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>BIOLOGIX</td>
			<td>15-1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial Drosophila Medium</td>
			<td>Boer</td>
			<td>B645446-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting needle</td>
			<td>Bioroyee</td>
			<td>17-9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garlic press</td>
			<td>Taobao</td>
			<td>No Catalog numbers</td>
			<td>Purchase on Taobao</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lucillia sericata pupae</td>
			<td>Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>No Catalog numbers</td>
			<td>Purchase on Taobao</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small writing brush</td>
			<td>Cestidur</td>
			<td>BL0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>SOPTOP</td>
			<td>RX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>SALMART</td>
			<td>A109001-56</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing the rearing procedure of germ-free wasps

La tecnología de cría aséptica es un método de cultivo de insectos en condiciones estériles o casi estériles, que puede eliminar eficazmente la influencia de microorganismos externos en la microbiota de los insectos y, por lo tanto, promover el rápido desarrollo de la investigación de la microbiota de los insectos. Nasonia (género de avispas) es un insecto avispa parásito que tiene muchas ventajas, como una vida útil corta, alta variación genética, fácil operación, etc., y es ampliamente utilizado como un sistema modelo de insectos. A diferencia del tratamiento antibiótico, que solo puede reducir el número de microorganismos en animales, las técnicas de cría aséptica pueden controlar tanto la composición como la cantidad de microorganismos en animales, facilitando aún más el estudio de las interacciones huésped-microbio. Sin embargo, las versiones anteriores del medio de cría Nasonia (NRM) tienen algunos defectos y problemas, como un proceso de preparación complejo y lento, fácil contaminación por bacterias u hongos y corto tiempo de almacenamiento. Por lo tanto, este estudio resuelve estos problemas optimizando las herramientas utilizadas en el proceso de preparación de MRN, las condiciones de almacenamiento y las proporciones de componentes. El medio optimizado podría permitir el almacenamiento a -20 °C durante al menos 3 meses y eliminar la posibilidad de contaminación por MRN durante la alimentación de avispas estériles. Esto mejora aún más la tasa de supervivencia y el nivel de salud de la Nasonia aséptica, que es importante para usar Nasonia como modelo para la investigación microbiana.

Germ-free animals are animals that have no detectable living microorganisms and parasites1. Germ-free embryos can be obtained by dissecting the mother under aseptic conditions and subsequently raised in barrier systems2. Such animals can be used to study the effects of microorganisms on animals, such as on the intestinal microbiota, immune system, and metabolism1. With certain technical means, many insects and even mammals can be rendered sterile3,4. Germ-free animals have a unique role and have been widely used in various aspects of microbiology research5. For example, the use of germ-free Nasonia wasps has revealed that microorganisms can help hosts adapt to new environments under long-term exogenous environmental stress6,7.
Nasonia parasitoids are small parasitic wasps that inject their eggs into the pupae of flies4. There are four known species of Nasonia, including Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti, and Nasonia oneida8. N. vitripennis can be found worldwide, while the other three species have limited ranges in North America4. Nasonia parasitoid wasps are regarded as ideal model insects because of their characteristics, such as easy cultivation, short reproduction cycle, sequenced genome, and long term diapause8,9. They can be used to study various aspects of insect evolution, genetics, development, behavior, and symbiosis10. Moreover, Nasonia parasitoid wasps can also help control harmful flies in agriculture and disease11. The successful establishment of a sterile insect system involves two major steps: (1) sterilization of the embryos and (2) provision of sterile food to the larvae in vitro. In order to obtain sterile food, Brucker and Bordenstein12 developed Nasonia rearing medium (NRMv1) in 2012 by using chemicals such as antibiotics, bleach, and fetal bovine serum to kill bacteria12. However, the chemical sterilization method resulted in low survival and eclosion rates of N. vitripennis13. Then, in 2016, Shropshire et al. developed NRMv2 by using a filter sterilization method instead of a chemical sterilization method to eliminate the hazards of antibiotics and other substances, and optimized the breeding process13. Unfortunately, this method still has some disadvantages, such as the challenges associated with preparing and using the medium, as well as the risks of drowning, underfeeding, or dehydration for the embryos, larvae, and closed pupae14. Wang and Brucker14 recently improved the Nasonia rearing media version 3 (NRMv3) and the germ-free rearing version 2 (GFRv2) protocols. These improvements reduced the cost and media consumption. However, the NRMv3 has a very short storage time and is highly susceptible to contamination.
Building on NRMv3, the NRM preparation tool storage method and nutrient ratio were optimized in this study. This methodological refinement facilitates using N. vitripennis as a model for microbiome studies. Compared with the NRMv3 developed by Wang et al.14, the improved tool for squeezing Sarcophaga bullata pupa, one of the NRM raw materials, greatly enhances the production efficiency of S. bullata pupa tissue fluid compared with the 60 mL syringe with a bottom hole used by Wang et al.14. We adjusted the nutrient ratio of NRM, which led to a certain increase in the survival rate of germ-free Nasonia wasps without affecting their development time. In addition, the NRM was packed into small-capacity centrifuge tubes (1.5 mL) and frozen in a -20 &#176;C refrigerator to extend the storage time. It is worth noting that while we used the housefly Lucilia sericata as the host and source for NRM preparation, this protocol can likely be adapted for other Nasonia hosts that are available in the laboratory.

Autor destacado: Optimización del procedimiento de cría de avispas libres de gérmenes  

Optimización del procedimiento de cría de avispas libres de gérmenes

Our research focuses on the study of insect-microbiota interactions, specifically investigating the impact of in those symbiotic bacteria and exploring the dynamics of host-microbe relationships. Germ-free Nasonia is an essential tool for conducting this research. Current research utilize technologies such as high-throughput sequencing, germ-free insect rearing, transcriptoptomics, proteomics, and advanced microscope.This tool enable comprehensive analysis and virtualization of insect-microbe host interaction for advancing our understanding of this field. The optimized the procedure for preparing the Nasonia Rearing Medium provides economic advantages and saves time and effort. Additionally, it effectively reduces the risk of NRM contamination during the feeding process, greatly improving the efficiency of producing aseptic Nasonia

La eficiencia de preparación de NRM se mejoró enormemente al mejorar las herramientas de preparación. Además, se eliminó el problema de la contaminación por MRN en el proceso de alimentación optimizando la estrategia y el método de preservación. Al mismo tiempo, el MRN ajustado tenía una proporción nutricional más adecuada para el crecimiento y desarrollo de avispas libres de gérmenes con L. sericata como huéspedes. La tasa de supervivencia de las avispas libres de gérmenes desde larvas hasta pupa...

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Los embriones de avispa Nasonia se diseccionaron de pupas de Lucillia sericata después de la parasitación durante 12-24 h y se lavaron con alcohol y solución de hipoclorito de sodio al 10% para obtener embriones libres de gérmenes. Después de criar los embriones libres de gérmenes y suministrarles el medio de cría Nasonia para crecer y desarrollarse in vitro, se obtuvieron adultos de Nasonia libres de gérmenes.

Aseptic rearing technology is a method of culturing insects under sterile or almost sterile conditions, which can effectively eliminate the influence of ...

Nuestra investigación se centra en el estudio de las interacciones insecto-microbiota, investigando específicamente el impacto de esas bacterias simbióticas y explorando la dinámica de las relaciones huésped-microbio. La Nasonia libre de gérmenes es una herramienta esencial para llevar a cabo esta investigación. La investigación actual utiliza tecnologías como la secuenciación de alto rendimiento, la cría de insectos libres de gérmenes, la transcriptoptómica, la proteómica y el microscopio avanzado.Esta herramienta permite el análisis integral y la virtualización de la interacción insecto-microbio huésped para avanzar en nuestra comprensión de este campo. El procedimiento optimizado para la preparación del Medio de Crianza Nasonia proporciona ventajas económicas y ahorra tiempo y esfuerzo. Además, reduce eficazmente el riesgo de contaminación por MRN durante el proceso de alimentación, mejorando en gran medida la eficiencia de la producción de Nasonia aséptica.

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Research

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Biology

Optimizing the Rearing Procedure of Germ-Free Wasps

1.3K vistas.  Chinese Academy of Sciences. Nuestra investigación se centra en el estudio de las interacciones insecto-microbiota, investigando específicamente el impacto de esas bacterias simbióticas y explorando la dinámica de las relaciones huésped-microbio. La Nasonia libre de gérmenes es una herramienta esencial para llevar a cabo esta investigación. La investigación actual utiliza tecnologías como la secuenciación de alto rendimiento, la cría de insectos libres de gérmenes, la transcriptoptómica, la proteómica y el ...

Video: Autor destacado: Optimización del procedimiento de cría de avispas libres de gérmenes  

Aseptic rearing technology is a method of culturing insects under sterile or almost sterile conditions, which can effectively eliminate the influence of external microorganisms on insect microbiota and thus promote the rapid development of insect microbiota research. Nasonia (wasp genus) is a parasitic wasp insect that has many advantages, such as a short lifespan, high genetic variation, easy operation, etc., and is widely used as an insect model system. Unlike antibiotic treatment, which can only reduce the number of microorganisms in animals, aseptic rearing techniques can control both the composition and quantity of microorganisms in animals, further facilitating the study of host-microbe interactions. However, previous versions of Nasonia rearing medium (NRM) have some defects and problems, such as a complex and time-consuming preparation process, easy contamination by bacteria or fungi, and short storage time. Therefore, this study solves these problems by optimizing the tools used in the NRM preparation process, storage conditions, and component ratios. The optimized medium could allow storage at -20 &#176;C for at least 3 months and eliminate the possibility of NRM contamination during feeding sterile wasps. This further improves the survival rate and health level of aseptic Nasonia, which is important for using Nasonia as a model for microbial research.

Nasonia wasp embryos were dissected from Lucillia sericata pupae after parasitization for 12-24 h and washed with alcohol and 10% sodium hypochlorite solution to obtain germ-free embryos. After rearing the germ-free embryos&#160;and supplying them with Nasonia rearing medium to grow and develop in vitro, germ-free Nasonia adults were obtained.

Investigación

Biología

Preparation of Germ-Free Nasonia Rearing Medium (NRM)

Preparation of Germ-Free Nasonia Rearing Medium (NRM)  

To begin, place commercially available Lucillia sericata pupae on a sheet of paper. Discard any underdeveloped larvae, dark old pupae, empty pupil shells, sawdust, or other impurities. Transfer young brownish red colored pupae to a beaker and immerse the pupae in deionized water.Wrap the beaker with tinfoil or gauze and shake it to clean any surface impurities off the pupae. Then discard the water. Place the cleaned pupae in the filter tank of a garlic press, and squeeze hard.Then collect the pupae tissue fluid in a 50-millimeter sterile centrifuge tube, and centrifuge it at 25, 000 x g for 10 minutes at four degrees Celsius. Using a 22-gauge sterile needle, collect the protein layer into a new 50-millimeter polypropylene centrifuge tube, and add commercial liquid drosophila medium at an equal ratio to the protein extract. To remove the particles of different sizes from the mixture, filter it using a vacuum filtration system with filter paper of different pore sizes.To prevent clogging change the filter paper when the flow slows down. Once the filtrate is centrifuged, sterilize the supernatant through a 0.22 micrometer syringe filter, and store the prepared nasonia rearing medium, or NRM aliquots, at 20 degrees Celsius until further use.

Preparación del medio de cría de nasonia libre de gérmenes (MRN)

Germ-Free Wasp Embryo Collection and Rearing with Nasonia-Rearing Medium (NRM)

Germ-Free Wasp Embryo Collection and Rearing with Nasonia-Rearing Medium (NRM)  

To begin, parasitize about 40 Lucilia sericata pupae onto emerging adult male and female Nasonia wasps mated for 1.5 days. Within 12 to 24 hours after parasitization, carefully open one end of the pupal shell using a sterile dissecting needle. Hold the other end of the shell and locate the wasp embryo.Then transfer the embryo to a sterile cell strainer moistened with PBS. Once 20 to 30 embryos have been transferred, wash them with 1, 000 microliters of 10%sodium hypochlorite solution followed by sterile PBS and 70%ethanol. Finally, wash them three times with sterile PBS.Next, place a polypropylene mesh sheet pre-wetted with PBS into a 24 well plate. Using a sterilized small brush, gently transfer the wasp embryos from the cell strainer to the polypropylene mesh sheet. For the wasp rearing, add 50 microliters of prepared NRM to each well with a sheet.Then add one milliliter of sterile water between each well to maintain a humid environment for growth. The next day, transfer the polypropylene mesh containing the larva from one well to another well using alcohol disinfected tweezers, and add 50 microliters of equilibrated NRM. After nine to 11 days of feeding, over 80%of the larva should develop into white or yellow pupae.then transfer the mesh to a clean well plate. In the present study, the survival rate of the germ-free wasps from larva to pupae was significantly improved compared to rearing germ-free wasps with NRM version three. Additionally, there was no difference in the generation period between the germ-free and conventionally reared wasps.