Los autores desean agradecer a Riccardo Urbanet por la asistencia técnica con los dispositivos de manejo de líquidos y a Rodi Odabasi por su apoyo con la microscopía de epifluorescencia. Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (números de subvención 310030E_202429 y 205321_204318) y Ectica Technologies AG.

Ensayo de cocultivo 3D: nichos osteogénicos vascularizados para el cribado de fármacos oncológicos

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Ectica Technologies AG es el fabricante de la placa de pozo de hidrogel 3DProSeed y tiene intereses comerciales. Benjamin R. Simona y Martin Ehrbar son accionistas de Ectica Technologies AG.

Aquí, describimos un protocolo para el establecimiento de un modelo in vitro de hueso altamente vascularizado y nichos de médula ósea en una matriz basada en PEG 3D totalmente sintética y controlable, que tiene una variedad de aplicaciones en la investigación de la biología ósea y de la médula ósea, la ingeniería de tejidos y la investigación del cáncer. Este modelo se basa en un hidrogel sintético basado en PEG que se funcionaliza con péptidos RGD y sitios de escisión MMP y se moldea con un gradiente de densidad en profundidad en placas de imágenes de 96 pocillos con fondo de vidrio30. Se demostró que esta plataforma plug-and-play permite el establecimiento de redes celulares 3D altamente interconectadas sin la necesidad de encapsular células en el hidrogel. Similar al protocolo de encapsulación celular descrito anteriormente, en este trabajo, mostramos la remodelación del sustrato mediante un ECM28 inherente a la célula para crear un microambiente específico para el tipo de célula. Por lo tanto, con este método, los ensayos de detección de fármacos y los análisis de alto contenido se pueden realizar fácilmente en condiciones de cultivo 3D organotípicas altamente reproducibles. Las placas de 96 pocillos con fondo de vidrio y los hidrogeles ópticamente transparentes hacen que la plataforma sea compatible con la automatización del manejo de líquidos y la microscopía de alto rendimiento.
El primer paso para generar un nicho de médula ósea vascular osteogénica es el precultivo de hBM-MSCs en el hidrogel PEG durante al menos 3 días. Durante este tiempo, se adhieren al hidrogel, lo penetran y comienzan a establecer contactos célula-célula y deposición de ECM. Antes de sembrar los hBM-MSC, se debe quitar el búfer de almacenamiento. Como el hidrogel está situado dentro de un pozo interior dentro del pocillo estándar de la placa de imágenes de 96 pocillos, es seguro insertar la punta de aspiración a lo largo del lado del pozo hasta que toque el anillo interior del pozo. Se puede usar una bomba de vacío para aspiración si se ajusta a la fuerza de succión más baja posible. Alternativamente, se puede usar una arandela de placas automatizada con la altura de la boquilla ajustada al menos a 0,8 mm por encima del anillo interior del pozo para aspirar el tampón de la placa de hidrogel. El uso de la automatización para el manejo de líquidos puede minimizar el daño a la superficie del hidrogel y conducir a una mayor reproducibilidad de los cultivos resultantes. Pequeños defectos en la superficie del hidrogel se hacen visibles una vez que las células se asientan en el hidrogel y aparecen en un plano de enfoque inferior en áreas de hidrogel defectuosas. Por lo tanto, la adquisición de imágenes de referencia en el día 0 sirve como un buen control de calidad para la homogeneidad de la siembra celular y la integridad de la superficie del hidrogel. Si bien los pequeños defectos superficiales de hidrogel no impiden el uso posterior del pozo, las células tienden a agruparse en las áreas defectuosas y pueden crecer en patrones no representativos o llegar más rápidamente al vidrio inferior, donde crecen en una monocapa. Estos artefactos deben tenerse en cuenta al usar/evaluar estos pozos. Consideraciones similares se aplican a cualquier cambio de medio realizado durante toda la duración del ensayo.
El segundo paso del protocolo implica la adición de GFP-HUVECs al monocultivo hBM-MSC preformado (día 0 de cocultivo). La ECM depositada por el hBM-MSC proporciona un gran andamio para el crecimiento de células endoteliales, que en este trabajo, incluso en presencia de medio condicionado por hBM-MSC, solo podrían formar grupos de células redondas en los hidrogeles (no se muestra). Al sembrar en los cultivos hBM-MSC, los HUVEC integran y forman estructuras similares a microvasos comparables a las observadas en cocultivos generados por encapsulación celular27,28. Por lo general, las redes microvasculares 3D bien desarrolladas se forman dentro de los 4 días posteriores al cocultivo, y esto puede ser monitoreado longitudinalmente mediante el uso de HUVEC marcados con GFP. Estas estructuras se pueden mantener durante al menos 7 días en cultivo, lo que significa que hay tiempo suficiente para seguir los cambios en la organización de la red vascular en respuesta a los tratamientos, como para la detección de fármacos antiangiogénicos. Los elementos morfológicos de la red endotelial se pueden cuantificar en modo por lotes segmentando las imágenes GFP utilizando herramientas bien establecidas, como el complemento Angiogenesis Analyzer de ImageJ33, y sus parámetros se pueden utilizar para evaluar, por ejemplo, la eficacia del fármaco y la farmacodinámica.
Una ventaja significativa del modelo celular descrito para muchas aplicaciones potenciales es su plasticidad. Simplemente complementar el medio de cultivo con diferentes factores de crecimiento puede cambiar la apariencia del cocultivo. Por ejemplo, la presencia de BMP-2 durante todo el período de monocultivo y cocultivo crea un nicho vascular osteogénico, mostrando una mayor actividad de ALP, deposición de calcio extracelular, así como ensamblaje y deposición de ECM. Por el contrario, en presencia de FGF-2, los marcadores osteogénicos están ausentes, y el cocultivo forma menos asociaciones celulares laterales, pero muestra un crecimiento celular 3D más pronunciado. El hecho de que FGF-2 suprime la actividad de ALP mientras que BMP-2 provoca una actividad de ALP más fuerte en comparación con ningún tratamiento con factor de crecimiento está de acuerdo con observaciones anteriores27. Sin embargo, a pesar de estas grandes diferencias en el componente estromal hBM-MSC, la extensión de la red microvascular fue muy similar para las dos condiciones tratadas con factor de crecimiento en este trabajo. En los cultivos de control, solo se formaron unas pocas redes vasculares cortas, lo que representa quizás un nicho de médula ósea poco vascularizado. Esto sugiere que simplemente cambiando el tipo, la concentración y el momento de los factores de crecimiento agregados al medio de cultivo, se podría producir una gama de nichos de médula ósea vascularizados bien definidos, como se requeriría para estudios comparativos. Sin embargo, para garantizar resultados reproducibles, es importante tener en cuenta que la progresión del cultivo y la morfología pueden variar dependiendo de la historia de las células utilizadas (por ejemplo, el número de paso y el método de desprendimiento utilizado durante el mantenimiento rutinario del cultivo), y es aconsejable controlar tales factores durante el diseño del ensayo.
Aquí, como primera aplicación de este modelo, demostramos la sensibilidad de las redes microvasculares diseñadas para el tratamiento con bevacizumab. En particular, es importante confirmar que el algoritmo utilizado puede reconocer con precisión la red endotelial, ya que los artefactos a menudo se generan en imágenes con redes poco desarrolladas. Si este es el caso, los parámetros utilizados para el procesamiento de imágenes (antes y durante la segmentación) deben ajustarse, a menudo sobre una base de prueba y error.
Como segunda aplicación, presentamos un modelo avanzado de cocultivo formado por la siembra secuencial de células mesenquimales, endoteliales y cancerosas. Este modelo permite estudiar las interacciones entre las células cancerosas, el estroma y la vasculatura de la médula ósea, que pueden ser factores importantes durante la metástasis. Además, este modelo podría usarse para aplicaciones de detección de medicamentos y probar compuestos con objetivos más allá de la angiogénesis.
En los cultivos 2D, las células no reciben señales microambientales fisiológicas, no adquieren morfologías celulares naturales y, en consecuencia, se diferencian de manera diferente en comparación con las células en ambientes3D nativos 35. Cuando se cultivan en hidrogeles 3D diseñados, las células depositan una ECM inherente desde el principio, que proporciona sitios de adhesión y puede ser remodelada activamente28,36. Aquí, para establecer un modelo 3D simplificado para aplicaciones de cribado, las células formadoras de vasos se sembraron en la superficie de hidrogeles diseñados y se les permitió establecer redes vasculares en ausencia de perfusión. Las evaluaciones basadas en imágenes se realizaron en proyecciones 2D de las células endoteliales que contribuyen a las estructuras vasculares. Sin embargo, solo las imágenes confocales revelaron el crecimiento menos pronunciado de las redes vasculares 3D en las muestras estimuladas por BMP-2 en comparación con las muestras estimuladas por FGF-2. Esto sugiere que la longitud de las estructuras vasculares formadas fue subestimada, mientras que su conectividad fue sobreestimada. Además, no se han investigado las interacciones entre las células perivasculares y endoteliales y la formación de luz vascular. Estos aspectos, especialmente en términos de respuestas al tratamiento farmacológico, requerirán mayor atención. Finalmente, los protocolos refinados para establecer primero extensas redes vasculares 3D y solo entonces inducir su diferenciación osteogénica serían deseables para generar modelos más fisiológicos de hueso y médula ósea.
En general, el modelo presentado aquí es muy versátil y se puede adaptar fácilmente a aplicaciones específicas. Por ejemplo, se podrían utilizar células mesenquimales y endoteliales de diferentes fuentes. Se sabe que las MSCs de tejido adiposo y las MSCs de cordón umbilical expresan diferentes factores angiogénicos en comparación con las BM-MSCs, pudiendo ser fácilmente sustituidas como un componente estromal alternativo37. También podrían utilizarse células endoteliales aisladas de nichos de médula ósea ya definidos en lugar de HUVECs. También se podría establecer el cocultivo con células mesenquimales y endoteliales de médula ósea derivadas del paciente para aplicaciones de medicina personalizada, como se ha sugerido recientemente para cocultivos musculares vascularizados38. Además, el diseño de la placa de hidrogel permite la monitorización longitudinal del cultivo tanto con microscopía de campo claro como de fluorescencia, ofreciendo así al usuario la posibilidad de acortar o extender el tiempo de cultivo dependiendo de la aplicación. Alternativamente, las densidades celulares utilizadas para la siembra podrían ajustarse en consecuencia para acelerar o retrasar la formación de la red celular si se necesitan tiempos de observación más cortos o más largos que los de este protocolo. En cualquier caso, se debe tener precaución para evitar el crecimiento excesivo de células en estructuras similares a láminas, lo que puede conducir a la contracción del hidrogel y al eventual desprendimiento celular.
Finalmente, se puede realizar una amplia gama de ensayos utilizando este modelo. Además de la inmunofluorescencia y la microscopía realizadas en cultivos vivos o fijos, los cultivos 3D pueden ser digeridos enzimáticamente, y las células pueden ser recuperadas y sometidas a cualquier tipo de ensayo bioquímico. Aquí, demostramos la determinación de la actividad de ALP y la cuantificación del contenido de ADN en lisados celulares utilizando ensayos colorimétricos / fluorométricos, pero el sistema es compatible con muchas otras técnicas, incluyendo PCR, RNAseq y proteómica. Si la sensibilidad del ensayo deseado no es muy alta, se pueden agrupar muestras de más de un pocillo para aumentar la cantidad de muestra disponible para el ensayo. Si la aplicación deseada requiere una disolución de gel más rápida, la agitación orbital de la placa podría aplicarse en combinación con volúmenes más pequeños de la solución digestiva para garantizar la formación de vórtices en los pozos, suponiendo que todos los pocillos de la placa se usarán de esta manera (los cultivos vivos son sensibles a un manejo tan duro). En resumen, presentamos aquí un protocolo que, si se utiliza como se describe, garantiza la generación de un modelo in vitro que recapitula los aspectos clave de los nichos vasculares osteogénicos, pero también es lo suficientemente versátil como para ser modificado para aplicaciones a medida.

El hueso y la médula ósea son órganos estructural y funcionalmente complejos fundamentales para la salud humana. Esto se refleja en la existencia de nichos distintos que regulan la hematopoyesis y el mantenimiento óseo1. Ahora se acepta ampliamente que en la médula ósea sana, el mantenimiento y la expansión de las células madre hematopoyéticas y esqueléticas, así como su progenie, están controlados por nichos distintos. Estos nichos comprenden varios tipos de células, incluyendo células de osteolinaje, células madre mesenquimales, células endoteliales y perivasculares, células neuronales y gliales, adipocitos, osteoclastos, macrófagos y neutrófilos2. No es sorprendente que estos nichos en su mayoría asociados a la vasculatura también estén involucrados en el desarrollo de varios tipos de leucemia3 y sean el sitio de metástasis para diferentes cánceres4. Debido a sus funciones específicas en la formación ósea, remodelación y mantenimiento óseo (médula), la vasculatura asociada al hueso tiene distintas estructuras especializadas diferentes de la vasculatura que se encuentra en otras partes del cuerpo 5,6,7. Así, los fármacos antiangiogénicos o moduladores de la vasculatura aplicados sistémicamente pueden tener diferentes efectos dentro de estos ambientes especializados8. Por lo tanto, los modelos para investigar los mecanismos moleculares implicados en el mantenimiento de las propiedades fisiológicas del hueso y la médula ósea, la regeneración ósea y de la médula ósea y las respuestas a los tratamientos terapéuticos son altamente deseables.
Los cultivos clásicos de tejidos bidimensionales (2D) y las investigaciones in vivo utilizando modelos animales han proporcionado información invaluable sobre los roles de diferentes células y actores moleculares involucrados en el desarrollo del hueso y la médula ósea 9,10. Los modelos que permiten experimentos de alto rendimiento con células humanas relevantes podrían mejorar nuestra comprensión de cómo modular parámetros seleccionados en estos sistemas altamente complejos.
En la última década, los principios derivados de la ingeniería de tejidos se han empleado para generar modelos de tejidos3D 11,12. Estos se han basado principalmente en la encapsulación de células relevantes para el tejido en biomateriales para establecer monocultivos o cocultivos 3D13. Entre los biomateriales más utilizados se encuentran la fibrina 14, el colágeno 15 y el Matrigel16,17, todos los cuales son altamente biocompatibles y proporcionan condiciones apropiadas para el crecimiento de muchos tipos de células. Estos biomateriales tienen la capacidad de generar modelos in vitro que recapitulan aspectos clave de los diferentes nichos vasculares encontrados in vivo18. Además, el uso de dispositivos microfluídicos para generar modelos vasculares perfundidos de hueso y médula ósea ha contribuido a la generación de modelos in vitro de mayor complejidad 19,20,21,22.
La dificultad para controlar la composición e ingeniería de las propiedades de los biomateriales naturales ha inspirado el desarrollo de análogos sintéticos que pueden ser diseñados racionalmente con propiedades físicas, químicas y biológicas predecibles23,24. Hemos desarrollado hidrogeles totalmente sintéticos a base de poli(etilenglicol) reticulado (PEG) del factor XIII (FXIII), que se funcionalizan con péptidos RGD y sitios de escisión de la metaloproteasa de matriz (MMP) para facilitar la unión celular y la remodelación25,26. El diseño modular de estos biomateriales se ha utilizado con éxito para optimizar las condiciones para la formación de modelos 3D vascularizados de hueso y médula ósea27,28.
Para la prueba de un mayor número de diferentes condiciones de cultivo y nuevas terapias, se requieren modelos con una mayor capacidad de rendimiento. Recientemente hemos demostrado que la reticulación FXIII de nuestro hidrogel PEG se puede controlar a través de un proceso electroquímico tal que se forma un gradiente de rigidez de hidrogel en profundidad29. Cuando se agregan células sobre tales hidrogeles, migran hacia el interior y gradualmente se convierten en redes celulares 3D altamente interconectadas30. La eliminación de la necesidad de encapsular células en el hidrogel, que suele estar presente con otros andamios 3D, no solo simplifica el diseño experimental, sino que también permite la adición secuencial de diferentes tipos de células en diferentes puntos de tiempo para generar complejos sistemas de cocultivo. Estos hidrogeles están disponibles prefabricados en placas de imágenes de 96 pocillos con fondo de vidrio, lo que hace que el establecimiento de cultivos 3D sea posible mediante protocolos de siembra celular manuales y automatizados. La transparencia óptica de los hidrogeles PEG hace que la plataforma sea compatible con la microscopía.
Aquí, presentamos un método sencillo para la generación y caracterización de nichos osteogénicos vascularizados dentro de esta plataforma sintética plug-and-play lista para usar. Mostramos que el desarrollo de redes vasculares puede ser estimulado con un factor de crecimiento comúnmente utilizado para inducir osteogénesis in vitro, la proteína morfogenética ósea-2 (BMP-2), mientras que la diferenciación osteogénica puede prevenirse mediante la suplementación del factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF-2)27,31. Las redes formadas son diferentes en comparación con las redes estimuladas por FGF-2 en términos de la apariencia general, así como la distribución celular y ECM. Además, monitorizamos la inducción osteogénica utilizando fosfatasa alcalina como marcador. Demostramos el aumento de la expresión de este marcador a lo largo del tiempo y comparamos la expresión con la de las redes estimuladas por FGF-2 utilizando métodos cualitativos y cuantitativos. Finalmente, demostramos la idoneidad de los nichos generados de este modelo para dos aplicaciones potenciales. En primer lugar, realizamos un ensayo de prueba de concepto de sensibilidad a los medicamentos agregando bevacizumab a nichos preformados y monitoreando la degradación de las redes vasculares en su presencia. En segundo lugar, agregamos células de cáncer de mama MDA-MB-231 y osteosarcoma U2OS a nichos osteogénicos preformados, lo que demuestra que los nichos se pueden usar para estudiar las interacciones entre las células cancerosas y su entorno.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microtubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-methyl-1-propanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3DProSeed hydrogel well plate</td>
			<td>Ectica Technologies</td>
			<td>ECT.PS1.001.096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen IV antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Laminin 1+2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated plate washer</td>
			<td>Agilent Biotek</td>
			<td>EL&#967;50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated washer/dispenser</td>
			<td>Agilent Biotek</td>
			<td>MULTIFLO FX equipped with a peristaltic pump 5uL cassette</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bevacizumab</td>
			<td>Evidentic</td>
			<td>ID PS-E07-2019-00119 A009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-02C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 R</td>
			<td>To centrifuge 2 mL tubes at 16100 x g during ALP analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Stellaris 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical 50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 649 Donkey anti-rabbit IgG (minimal x-reactivity) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>406406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 649 Goat anti-mouse IgG (minimal x-reactivity) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin (IST-9)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-59826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-HUVECs</td>
			<td>PELOBiotech</td>
			<td>PB-CAP-0001GFP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hBM-MSCs</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Isolated at University Hospital Basel; Papadimitropoulos A, Piccinini E, Brachat S, et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells from fresh bone marrow in a 3D scaffold-based system under direct perfusion. PLoS One. 2014;9(7):e102359</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 breast cancer cell line</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>Kindly obtained from J Massagu&#233; at the Memorial Sloan-Kettering Cancer Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM&#945;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>22571-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode imaging reader</td>
			<td>Agilent Biotek</td>
			<td>Cytation 1</td>
			<td>For automated imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode imaging reader - fluorescence and absorbance</td>
			<td>Agilent Biotek</td>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>For measuring absorbance and fluorescence intensity duing ALP analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Artechemis</td>
			<td>US 040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-rhodamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picro-Sirius Red Solution</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab246832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-Collagen I antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab260043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIGMAFAST BCIP/NBT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5655-25TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1064981000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic, anhydrous</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic, monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U2OS osteosarcoma cell line</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>Kindly obtained from J Snedeker at the Institute for Biomechanics, Zurich&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-trehalose dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>90208</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple establishment of a vascularized osteogenic bone marrow niche using pre-cast poly(ethylene glycol) (peg) hydrogels in an imaging microplate

El hueso y la médula ósea son órganos altamente vascularizados y estructuralmente complejos, y son sitios para el cáncer y la formación de metástasis. Los modelos in vitro que recapitulan las funciones específicas de la médula ósea y ósea, incluida la vascularización, que son compatibles con el cribado farmacológico son altamente deseables. Tales modelos pueden cerrar la brecha entre los modelos bidimensionales (2D) in vitro simplistas y estructuralmente irrelevantes y los modelos in vivo más caros y éticamente desafiantes. Este artículo describe un ensayo de cocultivo tridimensional (3D) controlable basado en matrices de poli(etilenglicol) (PEG) diseñadas para la generación de nichos vascularizados de médula ósea osteogénica. El diseño de la matriz PEG permite el desarrollo de cultivos celulares 3D a través de un simple paso de siembra celular que no requiere encapsulación, lo que permite el desarrollo de sistemas complejos de cocultivo. Además, las matrices son transparentes y están prefabricadas en placas de imagen de 96 pocillos con fondo de vidrio, lo que hace que el sistema sea adecuado para microscopía. Para el ensayo descrito aquí, las células estromales mesenquimales derivadas de la médula ósea humana (hBM-MSC) se cultivan primero hasta que se forma una red de células 3D suficientemente desarrollada. Posteriormente, se agregan células endoteliales de la vena umbilical humana que expresan GFP (HUVECs). El desarrollo del cultivo es seguido por microscopía de campo claro y fluorescencia. La presencia de la red hBM-MSC apoya la formación de estructuras vasculares que de otro modo no se formarían y que permanecen estables durante al menos 7 días. La extensión de la formación de redes vasculares se puede cuantificar fácilmente. Este modelo se puede ajustar hacia un nicho osteogénico de médula ósea complementando el medio de cultivo con proteína morfogenética ósea 2 (BMP-2), que promueve la diferenciación osteogénica de las hBM-MSC, según lo evaluado por el aumento de la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) en el día 4 y el día 7 del cocultivo. Este modelo celular se puede utilizar como una plataforma para cultivar varias células cancerosas y estudiar cómo interactúan con nichos vasculares específicos de hueso y médula ósea. Además, es adecuado para la automatización y los análisis de alto contenido, lo que significa que permitiría la detección de medicamentos contra el cáncer en condiciones de cultivo altamente reproducibles.

The bone and bone marrow are structurally and functionally complex organs central to human health. This is reflected by the existence of distinct niches that regulate hematopoiesis and bone maintenance1. It is now widely accepted that in healthy bone marrow, the maintenance and expansion of hematopoietic and skeletal stem cells, as well as their progeny, are controlled by distinct niches. These niches comprise various cell types, including osteolineage cells, mesenchymal stem cells, endothelial and perivascular cells, neuronal and glial cells, adipocytes, osteoclasts, macrophages, and neutrophils2. Not surprisingly, these mostly vasculature-associated niches are also involved in the development of various types of leukemia3 and are the site of metastasis for different cancers4. Owing to its specific roles in bone formation, remodeling, and bone (marrow) maintenance, the bone-associated vasculature has distinct specialized structures different from the vasculature found elsewhere in the body5,6,7. Thus, anti-angiogenic or vasculature-modulating drugs applied systemically may have different effects within these specialized environments8. Therefore, models to investigate the molecular mechanisms involved in maintaining the bone and bone marrow physiological properties, bone and bone marrow regeneration, and responses to therapeutic treatments are highly desirable.
Classical two-dimensional (2D) tissue cultures and in vivo investigations using animal models have provided invaluable insight into the roles of different cells and molecular players involved in the development of bone and bone marrow9,10. Models that allow for high-throughput experiments with relevant human cells could improve our understanding of how to modulate selected parameters in these highly complex systems.
In the past decade, principles derived from tissue engineering have been employed to generate 3D tissue models11,12. These have mostly relied on the encapsulation of tissue-relevant cells into biomaterials to establish 3D mono- or co-cultures13. Among the most used biomaterials are fibrin14, collagen15, and Matrigel16,17, all of which are highly biocompatible and provide appropriate conditions for the growth of many cell types. These biomaterials have the ability to generate in vitro models that recapitulate key aspects of the different vascular niches found in vivo18. Moreover, the use of microfluidic devices to generate perfused vascular bone and bone marrow models has contributed to the generation of in vitro models of higher complexity19,20,21,22.
The difficulty in controlling the composition and engineering the properties of naturally occurring biomaterials has inspired the development of synthetic analogs that can be rationally designed with predictable physical, chemical, and biological properties23,24. We have developed fully synthetic factor XIII (FXIII) cross-linked poly(ethylene glycol) (PEG)-based hydrogels, which are functionalized with RGD peptides and matrix metalloprotease (MMP) cleavage sites to facilitate cell attachment and remodeling25,26. The modular design of these biomaterials has been successfully used to optimize conditions for the formation of 3D vascularized bone and bone marrow models27,28.
For the testing of larger numbers of different culture conditions and new therapeutics, models with a higher throughput capability are required. We have recently shown that the FXIII cross-linking of our PEG hydrogel can be controlled through an electrochemical process such that an in-depth hydrogel stiffness gradient is formed29. When cells are added on top of such hydrogels, they migrate toward the interior and gradually develop into highly interconnected 3D cellular networks30. The elimination of the need to encapsulate cells into the hydrogel, which is usually present with other 3D scaffolds, not only simplifies the experimental design but also allows the sequential addition of different cell types at different time points to generate complex co-culture systems. These hydrogels are available pre-cast onto glass-bottom 96-well imaging plates, thus making the establishment of 3D cultures achievable by manual as well as automated cell seeding protocols. The optical transparency of the PEG hydrogels renders the platform compatible with microscopy.
Here, we present a straightforward method for the generation and characterization of vascularized osteogenic niches within this&#160;ready-to-use, synthetic plug-and-play platform. We show that the development of vascular networks can be stimulated with a growth factor commonly used for inducing in vitro osteogenesis, bone morphogenetic protein-2 (BMP-2), while osteogenic differentiation can be prevented by supplementation of fibroblast growth factor 2 (FGF-2)27,31. The networks formed are different when compared to FGF-2-stimulated networks in terms of the overall appearance, as well as the cell and ECM distribution. Moreover, we monitored the osteogenic induction using alkaline phosphatase as a marker. We demonstrate the increased expression of this marker over time and compare the expression to that in FGF-2 stimulated networks using qualitative and quantitative methods. Finally, we demonstrate the suitability of the generated niches of this model for two potential applications. Firstly, we performed a proof-of-concept drug sensitivity assay by adding bevacizumab to pre-formed niches and monitoring the degradation of the vascular networks in its presence. Secondly, we added MDA-MB-231 breast cancer and U2OS osteosarcoma cells to pre-formed osteogenic niches, showing that the niches can be used to study interactions between cancer cells and their environment.

Autor destacado: Establecimiento simple de un nicho de médula ósea osteogénica vascularizada utilizando hidrogeles prefabricados de poli(etilenglicol) (PEG) en una microplaca de imagen  

Establecimiento simple de un nicho de médula ósea osteogénica vascularizada utilizando hidrogeles de poli(etilenglicol) (PEG) prefabricados en una microplaca de imágenes

Most in vitro vascularization studies use naturally-derived matrices. While typically very conductive to biological processes, their inherent biological activity complicates the study of influences of single parameters. Here, we can selectively add our players of interest and assess how the system changes.The sequential seeding of cells on our blank slate synthetic hydrogels enables the formation of very defined niches. Here, hBMMSs colonize the hydrogels and deposit their inherent extracellular matrix. This provides the substrate for the subsequently seeded endothelial cells.This feature is not commonly found in other 3D in vitro models. The possibility to add different cell types sequentially allows for the creation of high-throughput compatible in vitro models with great complexity. These models can be adapted to generate more specific osteogenic vascularized niches and to investigate the functions of cellular and molecular players.

Los cultivos de nicho vascular se establecieron mediante la siembra secuencial de hBM-MSC y GFP-HUVEC en hidrogeles prefabricados basados en PEG con un gradiente de rigidez dentro de una placa de imagen de 96 pocillos (Figura 1). Los cultivos se monitorizaron longitudinalmente mediante microscopía de epifluorescencia en vivo y se caracterizaron aún más en puntos de tiempo seleccionados. El compartimiento extracelular se evaluó mediante tinciones directas de color y tinciones basadas en anticuerpos. La actividad de ALP se cuantificó después de recuperar y lisar las células de los nichos generados. Además, demostramos la idoneidad de esta plataforma para ensayos de sensibilidad a fármacos antiangiogénicos y como base para modelos de cocultivo de cáncer.
Los cocultivos de hBM-MSCs y HUVECs que expresan GFP se establecieron mediante la siembra de 3 x 104 células/pocillo en ausencia de factores de crecimiento o en presencia de FGF-2 o BMP-2 a 50 ng/mL, como se describe en el protocolo. Desde un punto de tiempo temprano, las diferencias entre los cultivos se pudieron observar tanto en las imágenes de campo claro como de fluorescencia que muestran solo los GFP-HUVEC (Figura 2A). Al observar las mismas áreas longitudinalmente, se pudieron observar diferencias en el desarrollo de los cultivos, como un desarrollo más rápido en presencia de FGF-2. En general, los cultivos parecían menos desarrollados en ausencia de cualquier factor de crecimiento, con menos células de cualquier tipo diseminándose y la presencia de áreas acelulares. En contraste, las imágenes de campo brillante mostraron las culturas más densas en presencia de BMP-2. Sin embargo, las redes vasculares se formaron en ambas condiciones que contienen factores de crecimiento, y las redes más extensas e interconectadas se formaron con FGF-2. Estas diferencias observadas también podrían cuantificarse utilizando Angiogenesis Analyzer for ImageJ. De hecho, la longitud total de la red fue más alta en presencia de FGF-2 y más baja en ausencia de factores de crecimiento (Figura 2B). El número de uniones que indican puntos de ramificación en las redes siguió la misma tendencia que la longitud total (Figura 2C). Por el contrario, ambas condiciones que contienen factores de crecimiento presentaron significativamente menos segmentos aislados, lo que indica una mayor interconectividad, que la condición sin ningún factor de crecimiento (Figura 2D). Además, las imágenes confocales 3D revelaron una penetración más fuerte de las células endoteliales en términos de profundidad en la condición estimulada por FGF-2 (Figura 2E).
Los cocultivos hBM-MSC/GFP-HUVEC se mantuvieron durante 7 días en presencia de FGF-2 o BMP-2 antes de ser fijados y teñidos para componentes de ECM. Las tinciones inmunocitoquímicas seguidas de microscopía de barrido láser confocal mostraron diferencias notables en la morfología del cultivo dependiendo del tipo de suplementación con factor de crecimiento (Figura 3A). Con FGF-2, el cultivo se organizó en estructuras microvasculares condensadas, que eran densas tanto en células endoteliales como mesenquimales, mientras que en presencia de BMP-2, las hBM-MSC abarcaban un área mucho más grande, como es evidente en las áreas más extensas positivas para F-actina y GFP negativas. Las proteínas ECM fibronectina y colágeno I se localizaron de manera similar, mientras que la laminina y el colágeno IV se concentraron más alrededor de las estructuras endoteliales. Sin embargo, este aumento de la concentración alrededor de las estructuras endoteliales fue mucho más pronunciado en presencia de FGF-2 que en presencia de BMP-2. Además de las tinciones basadas en anticuerpos, se realizaron tinciones directas de color para evaluar el estado fibrótico general de la ECM (tinción de rojo de Picrosirius; Figura 3B), así como la deposición de Ca en la ECM (tinción de rojo alizarina; Figura 3C) de los nichos formados. La tinción Picrosirius Red fue más fuerte y más extensa en los nichos cultivados con BMP-2, y la tinción Alizarin Red siguió la misma tendencia.
A continuación, los cultivos se caracterizaron en términos de su potencial osteogénico mediante la evaluación de la actividad de la fosfatasa alcalina como un marcador osteogénico temprano. En el día 4 y el día 7 del cocultivo, las células se recuperaron de los nichos digiriendo los hidrogeles con tripsina. Para cuantificar la actividad de ALP, se lisaron las células recuperadas y se realizó un ensayo de pNPP. Los valores obtenidos se normalizaron contra el ADN total de cada muestra para tener en cuenta las diferencias potenciales en el número de células a través de las condiciones. De hecho, se pudieron observar pequeñas diferencias entre el contenido de ADN de las condiciones, y se recuperaron la menor cantidad de células de la condición sin ningún factor de crecimiento (no se muestra). La actividad normalizada de ALP, sin embargo, varió mucho entre las condiciones, con una tendencia de aumento de la actividad con concentraciones más altas de BMP-2 y una meseta de 100 ng / ml (Figura 4A, B). Los niveles de actividad más bajos se identificaron para la condición que contiene 50 ng / ml FGF-2. Si bien se pudieron observar tendencias similares para ambos puntos de tiempo evaluados, todos los valores aumentaron significativamente con el tiempo en cultivo desde el día 4 hasta el día 7. Además del ensayo cuantitativo, la actividad ALP podría visualizarse cualitativamente utilizando tinción directa de color basada en la conversión de sustrato BCIP / NBT. Se observó una tinción púrpura más extensa e intensa en presencia de BMP-2 en comparación con FGF-2 (Figura 4C).
Para demostrar dos aplicaciones potenciales de los nichos osteogénicos caracterizados, se realizó un estudio de prueba de concepto de sensibilidad a los medicamentos y cocultivos de cáncer. Para el ensayo de sensibilidad al fármaco, se añadió bevacizumab o una solución de control consistente en el diluyente de la formulación de bevacizumab al medio de cultivo que contenía BMP-2 fresco. El día 4, cuando se formaron redes establecidas en presencia de 50 ng/mL BMP-2, se agregó la solución de control o el medio que contenía bevacizumab durante el cambio regular del medio, y los cultivos se monitorizaron mediante imágenes de fluorescencia. La adición de 10 μg/ml de bevacizumab condujo a la retracción o ablación de la red previamente formada, mientras que la condición de control todavía presentaba redes extensas 2 días después del cambio del medio (Figura 5A, B). Estos cambios también podrían cuantificarse mediante el seguimiento de la longitud total de las redes utilizando Angiogenesis Analyzer for ImageJ en imágenes de fluorescencia adquiridas diariamente (Figura 5C). Alternativamente, también se podría agregar bevacizumab o cualquier otro compuesto desde el inicio del cocultivo para evaluar su influencia en la formación de las redes. En el caso de bevacizumab, esto inhibió completamente la formación de redes endoteliales (no se muestra).
Para la segunda aplicación, se agregaron células de cáncer de mama MDA-MB-231 u osteosarcoma U2OS a cocultivos del día 4 a una densidad de 1.5 x 103 células/pocillo en medio de cultivo fresco que contenía 50 ng / ml BMP-2. Para distinguirlos de los HUVEC marcados con GFP y los hBM-MSC no marcados, las células cancerosas se incubaron con CellTrace FarRed justo antes de la siembra en los nichos osteogénicos. Los cultivos fueron monitoreados por microscopía de fluorescencia; Al principio, la mayoría de las células cancerosas se localizaban cerca de la superficie del sustrato, pero después de 2 días, se podían encontrar más cerca de las capas que contienen los cocultivos vasculares. Por lo tanto, se seleccionó el día 2 como punto de partida para la microscopía de lapso de tiempo para mostrar la dinámica de las interacciones entre las células cancerosas y las células dentro del nicho vascular. Curiosamente, se podía ver que las células MDA-MB-231 se acercaban y se alejaban de las estructuras endoteliales y, por lo tanto, posiblemente estaban sondeando o remodelando su entorno (Figura 5D). Usando CellTrace FarRed como una etiqueta para las células cancerosas, GFP como una etiqueta para HUVEC y tinción adicional para F-actina, todos los tipos de células podrían distinguirse utilizando microscopía de barrido láser confocal (Figura 5E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65413/65413fig01.jpg"> Figura 1: Un enfoque simple para la generación confiable de nichos osteogénicos vascularizados. Los hidrogeles sintéticos prefabricados con un gradiente de rigidez profundo permiten la generación de cultivos 3D a través de la siembra secuencial de células sin necesidad de encapsulación directa. Las hBM-MSC se precultivan durante 3 días antes de agregar las HUVEC que expresan GFP. Los cultivos se monitorean mediante la adquisición de señales de campo claro y GFP longitudinalmente. En puntos de tiempo seleccionados, los nichos se evalúan más a fondo por su deposición de ECM y estado osteogénico. La actividad de la fosfatasa alcalina se evalúa mediante tinción directa del color y recuperando células de los nichos y realizando un ensayo de pNPP en los lisados celulares. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65413/65413fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65413/65413fig02.jpg"> Figura 2: Estimulación de redes vasculares con FGF-2 o BMP-2. (A) Las imágenes de campo claro y fluorescencia (GFP) se adquirieron el día 2, el día 4 y el día 6 del cocultivo de células cultivadas en ausencia de factores de crecimiento o en presencia de FGF-2 o BMP-2, ambos a 50 ng / ml. Barra de escala: 400 μm. (B-D) Parámetros cuantificados de las redes GFP-HUVEC fotografiadas en el día 4 de cocultivo, analizadas utilizando Angiogenesis Analyzer for ImageJ. Los datos se representan como media ± desviación estándar. El análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism 9.5.1. Se realizó un ANOVA unidireccional ordinario con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett con n ≥ 4; * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. (E) Reconstrucciones tridimensionales generadas a partir de pilas confocales (altura total: 547.5 μm; paso z: 2.5 μm) de las señales GFP y F-actina para las condiciones estimuladas FGF-2- (fila superior) y BMP-2- (fila inferior). Barra de escala: 300 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65413/65413fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65413/65413fig03.jpg"> Figura 3: Inducción de propagación deslocalizada de hBM-MSC y deposición de ECM por BMP-2. (A-C) Los cocultivos de 7 días cultivados en presencia de FGF-2 o BMP-2 se sometieron a (A) inmunofluorescencia o (B, C) tinción directa del color. (A) Los cultivos se tiñeron para la actina F y las proteínas ECM fibronectina, laminina, colágeno I y colágeno IV. Las imágenes muestran las proyecciones de intensidad máxima de las pilas confocales (altura total: 100 μm; paso z: 5 μm). Barra de escala: 200 μm. (B,C) Los cultivos se tiñeron usando (B) Rojo Picrosirius y (C) Rojo Alizarina. La fila superior muestra resúmenes cosidos y completos de las imágenes adquiridas con un aumento de 2,5x (barra de escala: 1.000 μm), mientras que la fila inferior representa un campo de visión adquirido con un aumento de 5x (barra de escala: 400 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65413/65413fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65413/65413fig04.jpg"> Figura 4: Evaluación bioquímica de la actividad de la ALP inducida por BMP-2 mediante tinción directa del color. (A,B) La actividad ALP se determinó en los lisados celulares de cultivos cultivados en ausencia de factores de crecimiento o en presencia de BMP-2 a diferentes concentraciones o FGF-2 a 50 ng/mL durante (A) 4 días o (B) 7 días de cocultura. La actividad ALP se muestra normalizada al contenido de ADN de cada muestra de lisado. Los datos se representan como media ± desviación estándar. El análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism 9.5.1. Se realizó un ANOVA unidireccional ordinario con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett con n = 5; P < 0,0001. (C) Tinción directa del color de la actividad ALP en nichos cultivados en presencia de 50 ng/mL FGF-2 o BMP-2 durante 7 días de cocultivo. Las imágenes del lado izquierdo muestran resúmenes cosidos de imágenes adquiridas con un aumento de 2,5x (barra de escala: 1.000 μm), mientras que las imágenes del lado derecho representan un campo de visión adquirido con un aumento de 5x (barra de escala: 400 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65413/65413fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65413/65413fig05.jpg"> Figura 5: Empleo de nichos osteogénicos vascularizados en modelos avanzados de cáncer. (A) Las señales GFP de cultivos cultivados en presencia de BMP-2 se visualizaron en el día 4 de cocultivo antes de agregar una solución de control (izquierda) o bevacizumab a 10 μg / ml (derecha) durante 2 días, después de lo cual los cultivos se visualizaron nuevamente (día 6 de cocultivo). Barra de escala: 600 μm. (B) Las imágenes de mayor aumento de los cultivos tratados con bevacizumab se muestran en A. Barra de escala: 250 μm. (C) La longitud total de las redes endoteliales como se muestra en A se cuantificó utilizando Angiogenesis Analyzer for ImageJ a partir de imágenes adquiridas diariamente; n ≥ 3. (D) Se agregaron células de cáncer de mama MDA-MB-231 marcadas con FarRed de CellTrace a los cocultivos de 4 días cultivados en presencia de BMP-2, y se adquirieron imágenes de lapso de tiempo a partir de 2 días después de la adición de células cancerosas. Barra de escala: 100 μm. (E) Proyecciones de intensidad máxima de pilas confocales (altura total: 70 μm; paso z: 2,4 μm) de cocultivos triples generados como se describe en D y fijados y teñidos para F-actina. Izquierda: nichos con células de cáncer de mama MDA-MB-231; derecha: nichos con células de osteosarcoma U2OS. Barras de escala para imágenes a la izquierda: 200 μm; Barras de escala para imágenes a la derecha: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65413/65413fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Se establece un modelo in vitro del nicho vascular de la médula ósea mediante la siembra de células mesenquimales y endoteliales en hidrogeles PEG 3D prefabricados. Las redes endoteliales, los componentes de ECM y la actividad ALP de los nichos varían según el factor de crecimiento utilizado. La plataforma se puede utilizar para modelos avanzados de cáncer.

The bone and bone marrow are highly vascularized and structurally complex organs, and are sites for cancer and metastasis formation. In vitro models ...

La mayoría de los estudios de vascularización in vitro utilizan matrices derivadas naturalmente. Aunque típicamente son muy conductivos para los procesos biológicos, su actividad biológica inherente complica el estudio de las influencias de parámetros individuales. Aquí, podemos agregar selectivamente nuestros jugadores de interés y evaluar cómo cambia el sistema.La siembra secuencial de células en nuestros hidrogeles sintéticos de pizarra en blanco permite la formación de nichos muy definidos. Aquí, los hBMMS colonizan los hidrogeles y depositan su matriz extracelular inherente. Esto proporciona el sustrato para las células endoteliales posteriormente sembradas.Esta característica no se encuentra comúnmente en otros modelos 3D in vitro. La posibilidad de añadir diferentes tipos de células secuencialmente permite la creación de modelos in vitro compatibles de alto rendimiento con gran complejidad. Estos modelos se pueden adaptar para generar nichos vascularizados osteogénicos más específicos e investigar las funciones de los actores celulares y moleculares.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Simple Establishment of a Vascularized Osteogenic Bone Marrow Niche Using Pre-Cast Poly(ethylene Glycol) (PEG) Hydrogels in an Imaging Microplate

1.1K vistas.  University Hospital Zurich, University of Zurich. La mayoría de los estudios de vascularización in vitro utilizan matrices derivadas naturalmente. Aunque típicamente son muy conductivos para los procesos biológicos, su actividad biológica inherente complica el estudio de las influencias de parámetros individuales. Aquí, podemos agregar selectivamente nuestros jugadores de interés y evaluar cómo cambia el sistema.La siembra secuencial de células en nuestros hidrogeles sintéticos de pizarra en blanco permite la formación de ...

Video: Autor destacado: Establecimiento simple de un nicho de médula ósea osteogénica vascularizada utilizando hidrogeles prefabricados de poli(etilenglicol) (PEG) en una microplaca de imagen  

The bone and bone marrow are highly vascularized and structurally complex organs, and are sites for cancer and metastasis formation. In vitro models recapitulating bone- and bone marrow-specific functions, including vascularization, that are compatible with drug screening are highly desirable. Such models can bridge the gap between simplistic, structurally irrelevant two-dimensional (2D) in vitro models and the more expensive, ethically challenging in vivo models. This article describes a controllable three-dimensional (3D) co-culture assay based on engineered poly(ethylene glycol) (PEG) matrices for the generation of vascularized, osteogenic bone-marrow niches. The PEG matrix design allows the development of 3D cell cultures through a simple cell seeding step requiring no encapsulation, thus enabling the development of complex co-culture systems. Furthermore, the matrices are transparent and pre-cast onto glass-bottom 96-well imaging plates, rendering the system suitable for microscopy. For the assay described here, human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (hBM-MSCs) are cultured first until a sufficiently developed 3D cell network is formed. Subsequently, GFP-expressing human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) are added. The culture development is followed by bright-field and fluorescence microscopy. The presence of the hBM-MSC network supports the formation of vascular-like structures that otherwise&#160;would not form and that remain stable for at least 7 days. The extent of vascular-like network formation can easily be quantified. This model can be tuned toward an osteogenic bone-marrow niche by supplementing the culture medium with bone morphogenetic protein 2 (BMP-2), which promotes the osteogenic differentiation of the hBM-MSCs, as assessed by increased alkaline phosphatase (ALP) activity at day 4 and day 7 of co-culture. This cellular model can be used as a platform for culturing various cancer cells and studying how they interact with bone- and bone marrow-specific vascular niches. Moreover, it is suitable for automation and high-content analyses, meaning it would enable cancer drug screening under highly reproducible culture conditions.

An in vitro model of the bone marrow vascular niche is established by seeding mesenchymal and endothelial cells onto pre-cast 3D PEG hydrogels. The endothelial networks, ECM components, and ALP activity of the niches vary depending on the growth factor used. The platform can be used for advanced cancer models.

Investigación

Bioingeniería

Establishing the 3D Stromal Monoculture

To begin, take a tube of hBM-MSCs and pellet them by centrifugation. Discard the supernatant and resuspend the pellet in an appropriate volume of basal medium. Then, prepare 50 milliliter conical centrifuge tubes containing the required volume of basal medium supplemented with the respective growth factors.Finally, add the hBM-MSCs from the stock solution at a dilution of one to 66.67 to achieve a concentration of 1.5 times 10 to the fifth cells per milliliter. Remove the polypropylene adhesive film covering the 96 well hydrogel plate to seed the plate. Carefully aspirate the storage buffer covering the hydrogels by positioning the aspirator tip against the wall of the well and slowly moving toward the edge of the inner well.While seeding, mix the cell suspension periodically to keep the mixture homogenous and add 200 microliters of the cell suspension to each well of the plate. Then, maintain the cultures at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide in a humidified atmosphere. Alternatively, use an automated plate washer with the aspiration nozzles set at least 3.8 millimeters from the plate carrier and toward the edge of the well and aspirate the storage buffer.Seed the plate by mixing the cells with a serological pipette and dispensing equal numbers of cells to the well of the plate. Monitor the development of the cultures by Bright-field microscopy with a five times objective and acquire reference images approximately 30 minutes after seeding to evaluate the number of cells added.

Establecimiento del monocultivo del estroma 3D

Establishing the 3D Stromal-Endothelial Cell Co-Culture

To begin, take the pellet of the GFP-HUVECs grown to a confluence level of 80 to 100%and resuspend the cells in an appropriate volume of basal medium to achieve a concentration of one times 10 to the seventh cells per milliliter of stock solution. Prepare 50-milliliter conical centrifuge tubes containing the required volume of basal medium supplemented with the respective growth factors. Add the GFP-HUVECs from the stock solution at a dilution of one to 66.67 to achieve a concentration of 1.5 times 10 to the fifth cells per microliter.Then aspirate the medium from the plate containing the stromal monoculture and add 200 microliters per well of the prepared GFP-HUVECs suspension. Incubate at 37 degrees Celsius in 5%carbon dioxide in a humidified atmosphere, changing the medium every three to four days. Monitor the development of the culture by bright-field and fluorescence microscopy using a five times objective.Differences between the cultures could be observed from the bright-field and fluorescence images showing only the GFP-HUVECs. The cultures appeared less developed without any growth factor, However, faster development was observed in the presence of FGF-2. In contrast, the bright-field images showed the densest cultures in the presence of BMP-2.However, vascular like networks formed in both growth factor-containing conditions and the most extensive and interconnected networks were formed with FGF-2.

Establecimiento del cocultivo 3D de células estromales-endoteliales

Quantifying the Endothelial Cell Network Formation After the 3D Stromal-Endothelial Cell Co-Culture

After establishing the stromal endothelial cell co-culture, acquire the GFP signal from the GFP huvec using fluorescence microscopy with settings suitable for quantification. Pre-process all the images acquired on the same day to further enhance the contrast. If using fiji or image J open all the enhanced GFP channel images at the same time point and open the brightness and contrast menu.Select an image representing an intermediate condition and auto adjust the contrast by selecting auto. Click set and check propagate to all other open images. Visually assess whether the automatically selected range fits all the images of the current time point.If needed, manually readjust and repropagate the range to all the images and save the adjusted images as TIFF files. Next, apply a median blur filter to all the images. Reduce the size by binning and save them as gray scale RGB color TIFF files in a folder for quantification.This could be done manually or in batch mode using macros. Analyze all the created images using the batch process mode in the angiogenesis analyzer for image J.Then validate the quantification results by examining the overlays of the recognized structures and the original images. Adjust pre-processing parameters, reanalyze original images, or exclude problematic areas if the algorithm detects artificial structures with few or no cells visible in the original image.Finally normalize the obtained values to an area of one square millimeter by multiplying the values of each sample by the ratio of the analyzed area to one square millimeter. Quantified parameters of the GFP huvec networks showed that the total network length was highest in the presence of FGF-2 and lowest in the absence of growth factors. The number of junctions indicating branching points in the networks followed the same trend as the total length.Conversely, both growth factors featured significantly fewer isolated segments indicating higher interconnectivity than the condition without any growth factor.

Cuantificación de la formación de la red celular endotelial después del cocultivo 3D de células estromal-endoteliales

Assessing the Osteogenic Differentiation of 3D Stromal-Endothelial Cells by Monitoring the Alkaline Phosphatase Activity

To begin, take the hBM-MSCs and GFP-HUVECs co-culture and wash once with 200 microliters per well of PBS. Add the BCIP/NBT substrate solution and incubate the cultures at 37 degrees Celsius while periodically monitoring the color development. Once the color develops in non-osteogenic conditions, immediately washed with 200 microliters per well of PBS.After fixing the samples in 4%paraformaldehyde, acquire color images of the stained samples. To quantify the ALP activity in cell lysates, add 200 microliters per well of 0.25%Trypsin-EDTA to the cultures washed with PBS and incubate at 37 degrees Celsius. Agitate the cultures every 10 minutes by vigorously pipetting up and down to facilitate digestion and monitor the culture morphology with a standard cell culture microscope.Then transfer the samples to 2-milliliter tubes and add 200 microliters of mesenchymal stem cell basal medium to inhibit the Trypsin. After centrifusing and discarding the supernatant, freeze the pellets at 80 degrees Celsius or proceed directly to the next step. Thaw the cell pellets, add 500 microliters of lysis buffer, and incubate for 30 minutes on ice.Next centrifuge at 16, 100 G for 10 minutes at four degrees Celsius and keep the samples on ice. Without disturbing any pelleted debris, dispense 50 microliters of the supernatant into each well of a transparent tissue culture 96-well plate in duplicates. Add 50 microliters of the prepared alkaline phosphatase reagent to the wells of the 96-well tissue culture plate.Shake the plate briefly and incubate it at 37 degrees Celsius for 10 minutes protected from light. Stop the reaction by adding 100 microliters of 1-molar sodium hydroxide using a multi-channel pipette. Using a plate reader, read the optical density at 410 nanometers.For DNA quantification, thaw the frozen samples, centrifuge them, and place them on ice. Without disturbing any pelleted debris, dispense 50 microliters of the cell lysate supernatant into the wells of a black 96-well plate in duplicates. Add the DNA standards in duplicates.Next, use a multi-channel pipette to add 50 microliters of the DNA staining agent, then incubate and read the fluorescence intensity according to the manufacturer's instructions. Utilize the standard curve values to determine and apply the conversion of the measured intensity values to the DNA concentrations. Finally, normalize the alkaline phosphatase values by dividing them by the respective DNA concentration of each sample.Quantification of alkaline phosphatase activity to characterize the osteogenic potential of the cultures showed that the normalized alkaline phosphatase activity varied greatly across conditions with a trend of increasing activity with higher concentrations of BMP-2 and a plateau at 100 nanograms per milliliter. The lowest activity levels were identified for the condition containing 50 nanograms per milliliter FGF-2. More extensive and intense purple staining was observed in the presence of BMP-2 as compared to FGF-2.