Dank an die Umberto Veronesi Stiftung für ein Stipendium zur Unterstützung der Arbeit von Forschern.

1. Erstellung des grundlegenden 3D-rekonstruierten Darmschleimhautmodells
HINWEIS: Das gesamte Verfahren muss in einer sterilen Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden. Alle Schritte des Verfahrens, bei denen der Zellinkubator verwendet wird, bedeuten, dass die Kulturen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 inkubiert werden (sofern im Protokoll nicht anders angegeben).
<ol><li>Vorherige Präparation der im Darmmodellsystem verwendeten Zelllinien<ol><li>L929-Maus-Fibroblastenzellen in einer Konzentration von 5 x 105 in 5 ml des modifizierten Eagle-Mediums (DMEM) von Dulbecco, das 2 mM L-Glutamin, 10 % fötales Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin (Pen-Streptokokken) enthält, in einem F25-Kolben aussäen und 4 Tage vor dem Aufbau der Darmmodelle in einem Inkubator kultivieren. Nach 48 h wird das Medium mit einer Pipette entfernt. Dann fügen Sie frisches Medium (5 ml) hinzu und inkubieren Sie die Zellen 48 Stunden lang. HINWEIS: Die Zellen müssen vor der Verwendung zu 80 % konfluierend sein.</li>
		<li>Caco-2-Zellen (Konzentration von 2 x 106) in 10 mL DMEM-Medium (mit 10 % FBS und 1 % Pen-Streptokokken) in einen F75-Zellkolben geben und 4 Tage vor dem Aufbau des Darmschleimhautmodells in einem Inkubator kultivieren. Nach 48 h wird das Medium wie in Schritt 1.1.1 beschrieben gewechselt und 48 h lang bis zu einer Konfluenz von 80 % inkubiert. HINWEIS: Die Zellen müssen sich in einer aktiven proliferierenden Phase befinden: nicht zu spärlich oder zu konfluierend. Empfohlen wird eine 50-60%ige Konfluenz. Die Zellen dürfen nicht am Tag vor der Herstellung des Modells ausgesät werden, da dies die Proliferationsfähigkeit der Zellen verlangsamen könnte, die sich dann im rekonstruierten 3D-Modell nicht perfekt verankern würden.</li>
		<li>U937-Zellen, die in Suspension (Konzentration von 1 x 106) wachsen, zu 10 ml Medium des Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (enthält 2 mM L-Glutamin, 1 % Natriumpyruvat, 10 % FBS und 1 % Pen-Streptokokken) in einem F75-Zellkolben 2 Tage vor dem Modellaufbau hinzufügen und 48 Stunden lang in einen Inkubator geben.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung der Transwell Co-Kulturplatteneinsätze<ol><li>Wählen Sie eine 24-Well-Platte mit Einsätzen mit 0,4-μm-Filtern. HINWEIS: Der 0,4-μm-Filter ist eine Standardwahl für Arzneimitteltransportstudien. Die Filtergrößen von 3 μm und 8 μm werden nicht empfohlen, um mögliche Verluste der kollageneingebetteten Zellen zu verhindern.</li>
		<li>Befeuchten Sie die Transwell-Filter (im Folgenden als Membraneinsätze bezeichnet) mit einer Pipette mit 500 μl Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) unterhalb und oberhalb des Filtereinsatzes.</li>
		<li>Schließen Sie die Multi-Well-Platte und legen Sie sie für mindestens 2 h in einen Inkubator. HINWEIS: Die Membraneinsätze können bis zu 24 h im HBSS verbleiben. Dieser Vorgang kann am Tag vor der Erstellung des Modells durchgeführt werden. Es ist wichtig, dass die Membraneinsätze vollständig hydratisiert sind und der Filter nicht austrocknet, da dies die richtige Haftung der Probe erschweren könnte.</li>
		<li>Nehmen Sie die Platten nach 2 h (oder 24 h) aus dem Inkubator. Saugen Sie das HBSS vorsichtig von oberhalb und unterhalb der Membraneinsätze mit einer Pipette an und lassen Sie es 10 Minuten trocknen.</li>
	</ol></li>
	<li>Präparation der zellfreien Kollagen Lamina propria des grundlegenden 3D-Darmmodellsystems (TAG 1)<ol><li>Bereiten Sie eine zellfreie Kollagenlösung in einem sterilen 50-ml-Röhrchen auf Eis vor, die die folgenden Komponenten in DMEM enthält: 10 % fötales Kälberserum (FBS), 200 mM L-Glutamin, 1 % Natriumbicarbonat und 1,35 mg/ml Typ-1-Rattenschwanzkollagen. HINWEIS: Alle diese Komponenten müssen auf Eis aufbewahrt und mit gekühlten Pipettenspitzen in das DMEM gegeben werden. Das Typ-1-Rattenschwanzkollagen muss zuletzt hinzugefügt werden, da dieses mit steigender Temperatur und steigendem pH-Wert polymerisiert. Die Menge der hergestellten zellfreien Kollagenlösung hängt von der Anzahl der erforderlichen Darmäquivalente ab.</li>
		<li>Geben Sie 250 μl der Lösung in jeden Platteneinsatz (über dem Membranfilter) für die Anzahl der ausgewählten Darmäquivalente und legen Sie den Deckel auf die Multi-Well-Platte. Lassen Sie die Kollagenlösung bei Raumtemperatur (RT) unter der Laminar-Flow-Haube polymerisieren. HINWEIS: Neben dem Übergang in eine festere Phase zeigt sich die Polymerisation auch in einem Farbwechsel von Gelb zu Rosa. Die Polymerisation ist in der Regel innerhalb von 10-15 Minuten abgeschlossen.</li>
	</ol></li>
	<li>Präparation, Zellzählung und Zugabe von Fibroblasten- (L929) und Monozytenzellen (U937) zum Modellsystem (DAY 1)<ol><li>Entnehmen Sie die L929-Zellkultur (Schritt 1.1.1) aus dem Inkubator. Saugen Sie das Medium mit einer Vakuumpumpe an, ersetzen Sie es durch 5 ml sterile Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS; ohne Ca und Mg) und spülen Sie die Zellen.</li>
		<li>Saugen Sie das PBS mit einer Vakuumpumpe an. Fügen Sie 2 ml einer vorgefertigten Trypsin-EDTA-Lösung (0,05 % Trypsin und 0,02 % EDTA in PBS) hinzu und legen Sie sie für 3-5 Minuten in einen Inkubator.</li>
		<li>Verwenden Sie ein inverses Mikroskop (z. B. Eclipse Ts2, Nikon), um festzustellen, ob sich die Zellen von der Adhäsionsfläche lösen. Wenn dies der Fall ist, fügen Sie sofort 2 ml DMEM (mit 10 % FBS) hinzu, um die Trypsinreaktion zu blockieren, und spülen Sie die Zellen.</li>
		<li>Die Zelllösung wird in ein steriles 15-ml-Röhrchen überführt und 5 Minuten lang bei 645 x g zentrifugiert. Saugen Sie den Überstand mit einer Vakuumpumpe an. HINWEIS: Es ist darauf zu achten, dass das Pellet nicht gestört wird. Die Wirkung von DMEM wurde an den L929- und U937-Zellen getestet und es wurde nicht gezeigt, dass sie nachteilige Auswirkungen auf das Wachstum hat.</li>
		<li>Geben Sie 1 ml DMEM in das Pellet und suspendieren Sie die Zellen. HINWEIS: Die Zellen müssen homogen in der Lösung suspendiert sein.</li>
		<li>Entfernen Sie 20 μl der Zellen in DMEM und fügen Sie 20 μl Trypanblaulösung hinzu. Entnehmen Sie 20 μl der Mischung und bewerten Sie die Zelldichte mikroskopisch mit einer Zellzählkammer.</li>
		<li>Entfernen Sie die U937-Zellkultur (Schritt 1.1.3) aus dem Inkubator. Die Zelllösung wird bei 645 x g 5 min zentrifugiert. Saugen Sie den Überstand mit einer Vakuumpumpe an, um eine Störung des Pellets zu vermeiden.</li>
		<li>Suspendieren Sie die Zellen in 1 ml RPMI. Achten Sie wie bei den L929-Zellen darauf, dass die Zellen homogen in der Lösung suspendiert sind.</li>
		<li>In ähnlicher Weise ist die Zelldichte wie in Schritt 1.4.6 beschrieben zu bestimmen.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Kollagenlösung wie in Schritt 1.3.1 beschrieben vor. HINWEIS: Die Menge der herzustellenden Lösung muss 450 μl für jeden Einsatz (oder jedes Modell) berücksichtigen.</li>
		<li>Bereiten Sie eine DMEM-Lösung vor, die eine Anzahl von 50.000 L929-Zellen bzw. 15.000 U937-Zellen in einem Volumen von 50 μl für jedes zu konstruierende Darmäquivalentmodell enthält. HINWEIS: Die Anzahl der Zellen ist ein kritischer Faktor. Zu viele von beiden Zelltypen würden zu einer Lamina propria führen, die übermäßig mit Zellen gefüllt ist, die nicht ausreichend organisiert wären. Eine geringere Anzahl von Fibroblasten (die Kollagen produzieren) würde zu einer weniger kompakten Lamina propria führen, während zu wenige Monozyten die Immunantwort auf Reize behindern würden. Unter der Voraussetzung, dass die richtige Anzahl von Zellen in jedem 50-μl-Aliquot vorhanden ist, kann ein Gesamtvolumen von 600 μl für die 12 Filtereinsätze in jeder 24-Well-Platte hergestellt werden.</li>
		<li>In Schritt 1.4.10 werden jeweils 50 μl Aliquot mit den Zellen zu 450 μl Kollagenlösung gegeben. Gründlich mischen.</li>
		<li>Übertragen Sie die vorbeschichtete zellfreie Kollagenlamina propria für jedes Modell mit 500 μl der kollagenhaltigen Zelllösung. HINWEIS: Es ist wichtig, die Volumina schnell zu jedem Einsatz hinzuzufügen, und daher ist es ratsam, die Anzahl der rekonstruierten Darmschleimhautmodelle auf 12 oder weniger gleichzeitig zu begrenzen.</li>
		<li>Schließen Sie die Platte und legen Sie sie für 2 Stunden in einen Inkubator, damit die Lösung aushärten kann.</li>
	</ol></li>
	<li>Präparation, Zellzählung und Zugabe von epithelialen Caco-2-Zellen zum Darmmodell (TAG 1)<ol><li>Entnehmen Sie die Caco-2-Zellkultur (Schritt 1.1.2) aus dem Inkubator. Wiederholen Sie die Verfahren aus Schritt 1.4.1 mit 10 ml PBS zum Vorspülen. Dann 5 ml einer vorgefertigten Trypsin-EDTA-Lösung (0,05 % Trypsin und 0,02 % EDTA in Ca- und Mg-freiem PBS) zugeben und für 5-8 Minuten in einen Inkubator geben.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.4.3 (aber mit 5 ml DMEM, um die Trypsinreaktion zu blockieren) bis 1.4.6, um die Zellen mit der Zellzählkammer zu zählen.</li>
		<li>Bereiten Sie eine DMEM-Lösung vor, die eine Anzahl von 150.000 Caco-2-Zellen in 50 μl enthält. HINWEIS: Die Anzahl der verwendeten Zellen ist ein kritischer Punkt. Bei mehr als 150.000 Zellen kann es zu einer kompakten, desorganisierten Epithelschicht kommen, während bei zu wenig (weniger als 100.000) die Zellen Schwierigkeiten haben zu wachsen und die Basalmembran nicht ausreichend bedecken, wodurch eine diskontinuierliche Darmepithelschicht entsteht. Stellen Sie sicher, dass die Zellen effektiv aufgehängt sind. Die Spitze einer 200-μl-Pipette kann verwendet werden, um eine homogene Verteilung zu gewährleisten. Da 12 Modelle gleichzeitig konstruiert werden können, kann eine 600-μl-Zelllösung hergestellt werden.</li>
		<li>Nach Ablauf der in Schritt 1.4.14 geforderten 2 Stunden werden 50 μl in DMEM suspendierte Caco-2-Zellen in die Mitte jeder Basalmembran gegeben. Schließen Sie den Deckel der Multiwell-Platte.</li>
		<li>Unter der sterilen Laminar-Flow-Haube 10 Minuten inkubieren. Dann für 30 Minuten in den Inkubator geben.</li>
		<li>Bereiten Sie eine DMEM-Lösung vor, die 10 % FBS und 1 % Pen/Streptokokken enthält. HINWEIS: Bereiten Sie eine ausreichende Lösung vor, um ein Volumen von 1 ml pro Modell zu verwenden.</li>
		<li>Fügen Sie 500 μl des Mediums über dem rekonstruierten Modell und 500 μl unter dem Filter hinzu. HINWEIS: Beim Hinzufügen des Mediums über dem Filter ist Vorsicht geboten, um ein Ablösen oder Belasten der Zellen zu vermeiden.</li>
		<li>Schließen Sie das Multi-Well-Plattensystem und legen Sie es in den Inkubator.</li>
	</ol></li>
	<li>Modellvorbereitung/-bildung und -nutzung (TAG 2 bis TAG 6)<ol><li>TAG 2: Entfernen Sie die Lösung vorsichtig mit einer Pipette sowohl oberhalb des rekonstruierten Modells als auch unterhalb des Filters. Ersetzen Sie sie durch frische 500 μl frisches DMEM (10 % FBS und 1 % Pen/Streptokokken) über bzw. unter dem Filter.</li>
		<li>TAG 3: Wiederholen Sie den Vorgang wie oben in Schritt 1.6.1.</li>
		<li>TAG 4: Wiederholen Sie den Vorgang wie oben in Schritt 1.6.1. HINWEIS: Bei diesem Darmmodell handelt es sich um ein statisches Zellmodell. Um die Freisetzung von Molekülen und das Wachstum und die Stimulation von Zellen zu begünstigen, ist es daher sehr wichtig, dass das Medium jeden Tag gewechselt wird.</li>
		<li>TAG 5: Zu diesem Zeitpunkt ist das Modell vollständig ausgebildet/entwickelt. Verwenden Sie diese Modelle für weitere Studien. HINWEIS: Die beste Zeit für die Verwendung des Modells liegt bei 5 Tagen. Obwohl die Zellen über einen längeren Zeitraum in einem Inkubator gehalten werden können, ist die Wahrscheinlichkeit umso größer, dass die Epithelzellen unkontrolliert wachsen, je mehr Zeit vergeht, was zu einer unorganisierten und kompakten Schicht führt, die schwer zu verwenden ist.</li>
		<li>Nach 5 Tagen inkubieren Sie die Modelle entweder mit toxischen (Gluten oder Lipopolysaccharid [LPS]) oder nützlichen Komponenten (Polyphenole), die von Interesse sind. Fügen Sie diese dem oberen Teil des rekonstruierten Modells hinzu, das im DMEM-Medium aufgehängt ist. ANMERKUNG: Die geeignete Konzentration jeder interessierenden Komponente muss berechnet und in einem DMEM-Medium suspendiert werden. Unbehandelte Kontrollen, die nur DMEM-Medium enthalten, müssen für den Vergleich mit den experimentellen Modellen eingerichtet werden.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Kontroll- und Versuchsmodelle für 24 Stunden in einem Inkubator.</li>
		<li>TAG 6: Entfernen Sie das Medium oberhalb und unterhalb des Filters mit einer Pipette. HINWEIS: Das Medium kann für nachfolgende ELISA-Tests (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) aufbewahrt werden, um die Freisetzung von entzündlichen Zytokinen zu messen. Dazu muss das Medium in sterile Fläschchen gegeben und zur weiteren Analyse bei -20°C gelagert werden.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Paraffineinbettung der rekonstruierten Darmschleimhautmodelle
HINWEIS: Das gesamte Verfahren muss unter einem chemischen Abzug durchgeführt werden. Jeder Schritt und die jeweilige Zeiteinteilung müssen strikt eingehalten werden. Aus diesem Grund ist es wichtig, alle Reagenzien im Voraus vorzubereiten.
<ol><li>Stellen Sie die Paraffinmaschine auf 58 °C ein, damit sie einsatzbereit ist.</li>
	<li>Übertragen Sie die Membraneinsätze mit einer Zange in eine sterile 24-Well-Platte in saubere Wells.</li>
	<li>500 μl 37% gepuffertes Formalin in PBS über dem Filter und 1 ml unter dem Filter zugeben. Schließen Sie den Deckel und lassen Sie ihn 2 h bei RT unter dem chemischen Abzug. HINWEIS: Alternativ kann 4% gepuffertes Formalin bei RT für 1 h verwendet werden.</li>
	<li>Entfernen Sie das Formalin und fügen Sie die HBSS-Lösung sowohl über als auch unter dem Filter hinzu. Entfernen Sie dann das HBSS.</li>
	<li>Lösen Sie die Lamina propria vom Membraneinsatz. HINWEIS: Die Zellen der Darmschleimhaut lösen sich in der Regel sehr leicht vom Membraneinsatz, da sie nicht an diesem befestigt sind. Darüber hinaus bleiben die beiden Probenkompartimente (apikal und basal) befestigt, wodurch die 3D-Struktur erhalten bleibt. Wenn sie sich aus irgendeinem Grund nicht leicht ablösen lassen, ist es wichtig, eine sterile Einweg-Skalpellklinge zu verwenden, um die Darmschleimhaut aus dem Membraneinsatz zu entfernen. Die Membraneinlage kann geschnitten werden, wodurch sie sich vom Kunststoff löst. Achten Sie darauf, die Probe niemals mit dem Skalpell zu berühren. Das Motiv für die Entfernung des Membraneinsatzes aus den kollageneingebetteten Zellen ist, dass sich dieser Filter in den nachfolgenden Fixierungs- oder Paraffineinbettungsphasen ablösen kann, was Vergleiche zwischen Darmschleimhautmodellen unverhältnismäßig macht. Darüber hinaus haben die Membraneinsätze innerhalb des eingebetteten Abschnitts eine unterschiedliche Konsistenz, die das Schneiden beeinträchtigen kann.</li>
	<li>Stellen Sie die 100-ml-Bechergläser unter den chemischen Abzug, wobei jeder Becher korrekt beschriftet ist, um ein rekonstruiertes Darmschleimhaut-Modellsystem zu enthalten, das untersucht wird. Geben Sie 25 ml 35% ETOH in jedes Becherglas und fügen Sie dann die rekonstruierte Darmschleimhaut hinzu. 10 Min. inkubieren.</li>
	<li>Ersetzen Sie das 35%ige Ethanol durch 25 ml 50%iges Ethanol und inkubieren Sie es 10 Minuten lang.</li>
	<li>Ersetzen Sie das 50%ige Ethanol durch 25 ml 70%iges Ethanol und inkubieren Sie es 10 Minuten lang.</li>
	<li>Ersetzen Sie das 70%ige Ethanol durch 25 ml 80%iges Ethanol und inkubieren Sie es 10 Minuten lang.</li>
	<li>Ersetzen Sie das 80%ige Ethanol durch 25 ml 95%iges Ethanol und inkubieren Sie es 10 Minuten lang.</li>
	<li>Ersetzen Sie das 95%ige Ethanol durch 25 ml 100%iges Ethanol und inkubieren Sie es 10 Minuten lang.</li>
	<li>Ersetzen Sie das 100%ige Ethanol durch einen weiteren 25-ml-Wechsel von 100%igem Ethanol und inkubieren Sie es für 10 Minuten.</li>
	<li>Stellen Sie 100-ml-Bechergläser unter den Abzug, die jeweils korrekt beschriftet sind, um ein zu untersuchendes Modell zu enthalten. Fügen Sie 50 ml Xylol oder ein histologisches Reinigungsmittel für 10-20 Minuten hinzu. HINWEIS: Histo-Clear (histologisches Clearingmittel) wird empfohlen, da das Mittel die Klarheit und Lebendigkeit acidophiler Färbungen verbessert. Die Clearingzeit kann von einer rekonstruierten Darmschleimhautprobe zur anderen variieren und muss alle 2-3 min auf Transparenz im Erscheinungsbild überprüft werden.</li>
	<li>Sobald die Proben durchsichtig sind, legen Sie sie in einen Gewebekassettenhalter aus Metall, der dann in der beheizten Maschine für 45 Minuten in flüssiges Paraffin getaucht wird.</li>
	<li>Wechseln Sie das Paraffin und lassen Sie die Proben weitere 45 Minuten in der beheizten Maschine.</li>
	<li>Entfernen Sie den Taschentuchkassettenhalter und legen Sie ihn zum Abkühlen auf Eis. Wenn sich die gekühlten Probenblöcke vom Metallhalter lösen, können diese bei Raumtemperatur weiter gekühlt werden.</li>
	<li>Bewahren Sie die Blöcke bei RT auf. HINWEIS: Wenn das Ziel darin besteht, Abschnitte sofort vorzubereiten, können die Blöcke bei 4 ° C platziert werden, damit sie bei der Verwendung gut gekühlt sind.</li>
	<li>Schneiden Sie 4-μm-Schnitte mit einem Mikrotom.</li>
	<li>Legen Sie die geschnittenen Abschnitte auf Objektträger und trocknen Sie sie 24 h lang in einem Ofen bei 37 ° C.</li>
	<li>Die Folien sind gebrauchsfertig. Lagern Sie sie bei RT, bis Sie entweder eine H&E-histologische Färbung oder eine immunhistochemische Reaktionsfärbung (Antigen-Antikörper-Typ) durchführen.<ol><li>Für die immunhistochemische Färbung wählen Sie die interessierenden Antikörper aus (entweder für die Untersuchung von TJ-Proteinen wie Occludin oder für die Aktivierung, Migration und Differenzierung von Monozyten) und weisen Sie die Expression (durch Färbung) mit kommerziellen Kits nach.</li>
		<li>In ähnlicher Weise ist der Schleim mit dem Alcianblau und dem Periodsäure-Schiff (PAS) Färbekit zu messen.</li>
		<li>Quantifizieren Sie die gefärbten TJ-Proteine von Interesse, wie z. B. Occludin, indem Sie den Prozentsatz der positiven Pixel auf mikroskopischen Aufnahmen berechnen, die mit dem Mikroskop aufgenommen wurden.</li>
		<li>Analysieren Sie Bilder der Zellen mit einer Bildanalysesoftware (z. B. ImageJ2-Software [Wayne Rasband, Version 2.9.0/1.53t]).<ol><li>Um die Analyse der Pixel durchzuführen, verarbeiten Sie die digitalen Bilder auf 300 Pixel/Zoll und konvertieren Sie sie in 8 Bit. Verarbeiten Sie dann die binären Bilder mit dem Color Deconvolution-Plugin , um die Färbung des interessierenden Proteins zu analysieren, in diesem Fall die permanente rote Färbung von Occludin.</li>
			<li>Speichern Sie das ausgewählte Bild als TIFF-Datei und unterziehen Sie es einer "Bereinigung", um Artefakte mit einem Grafikeditor (z. B. Adobe PhotoshopCC [Version 20.0.4]) zu entfernen.</li>
			<li>Messen Sie anschließend alle relevanten Felder mit der Anwendung Particle of ImageJ2 analysieren und geben Sie die Daten als Anzahl der Pixel an. HINWEIS: Jedes Experiment sollte in dreifacher Ausführung durchgeführt werden, wobei für jedes Replikat drei interne Replikatfelder analysiert werden. Zur Quantifizierung des Schleims kann das gleiche Prinzip der Messung der Pixel auf die Bilder angewendet werden, die von den violett-magenta-gefärbten neutralen Mucinen bzw. hellblau gefärbten sauren Schleimen aufgenommen wurden.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

Konstruktion eines 3D-Darmschleimhautmodells mit Paraffineinbettung

<ol>
	<li>Chelakkot, C., Ghim, J., Ryu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+intestinal+barrier+integrity+and+its+pathological+implications.">Mechanisms regulating intestinal barrier integrity and its pathological implications.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).</li><li>Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. 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Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Das hier vorgestellte grundlegende rekonstruierte Modellsystem der Darmschleimhaut (Abbildung 6) kombiniert physiologische Komplexität (physiologisch relevantere 3D-Zellkulturen, die eine Caco-2-Monoschicht mit einem EZM-reichen Lamina-propria-Träger mit Fibroblasten und Monozyten enthalten) mit experimenteller Einfachheit (Verwendung kommerzieller humaner Zelllinien zur Herstellung eines standardisierten und leicht wiederholbaren Systems)13. Daher wird dieses Model...

Die intestinale Epithelbarriere, eine eine Zelle dicke innere Auskleidung, die verschiedene Arten von Epithelzellen enthält, stellt die erste physikalische Abwehrbarriere oder Schnittstelle zwischen dem äußeren und dem inneren Milieu des Körpers dar 1,2. Enterozyten vom Säulentyp stellen die am häufigsten vorkommende Art von Epithelzellen dar. Diese sind für die Aufrechterhaltung der Integrität der epithelialen Barriere durch Wechselwirkungen zwischen mehreren Barrierekomponenten, einschließlich Tight Junctions (TJs), verantwortlich und spielen eine wichtige Rolle bei der Straffung der Barriere 1,3. Die TJ-Struktur besteht aus intrazellulären Plaqueproteinen wie Zonula occludens (ZO) und Cingulin, die mit Transmembranproteinen zusammenarbeiten, einschließlich Occludinen, Claudinen und junktionalen Adhäsionsmolekülen (JAMs), die eine reißverschlussartige Struktur bilden, die die benachbarten Zellen fest miteinander verbindet 3,4. Die Transmembranproteine regulieren die passive parazelluläre Diffusion kleiner Verbindungen und schließen toxische große Moleküle aus.
Potenziell toxische Lebensmittelverbindungen und Lebensmittelkontaminanten stimulieren die Produktion von entzündlichen Zytokinen, die die epitheliale Permeabilität stören, Immunzellen aktivieren und chronische Entzündungen des Darmgewebes verursachen 5,6,7. Im Gegensatz dazu wurde berichtet, dass verschiedene antioxidative und entzündungshemmende Phytochemikalien die inflammatorische Zytokinexpression reduzieren und die Integrität der intestinalen TJ-Barriere durch die Wiederherstellung der TJ-Proteinexpression und -assemblierung verbessern 4,6,8. Daher hat die Regulierung der Integrität der Epithelbarriere sowohl durch nützliche als auch durch schädliche Verbindungen zu einer Zunahme der Verwendung von In-vivo- und In-vitro-Modellen geführt, die darauf abzielen, die Darmbarriere für pharmazeutische Screening- und Toxizitätsstudien nachzuahmen. Dies ist besonders relevant angesichts des zunehmenden Interesses am Verständnis der Pathophysiologie von Darmerkrankungen (CED), nekrotisierender Enterokolitis und Krebs, die in experimentellen Modellen simuliert werden können 8,9,10.
Gefragt ist die Entwicklung von zellbasierten In-vitro-Modellen, um das Ziel der "3R" im Tierversuch zu erreichen. Dazu gehören Ersatzalternativen zur Verwendung von Tieren, die Verringerung der Anzahl der verwendeten Tiere und die Verfeinerung der Anwendung von Methoden zur Linderung von Not 11,12,13. Darüber hinaus sind die zugrundeliegenden molekularen, zellulären und physiologischen Mechanismen zwischen menschlichen und murinen Modellen (Nagetiere sind die am weitesten verbreitete Spezies) unterschiedlich, was zu einer Kontroverse über die Wirksamkeit der murinen Modelle als Prädiktoren für menschliche Reaktionen führt12,13. Zu den zahlreichen Vorteilen von In-vitro-Modellen humaner Zelllinien gehören zielbeschränkte Experimente, direkte Beobachtung und kontinuierliche Analyse13.
Einzelzell-Monoschichten in zweidimensionalen (2D) Kulturen haben als leistungsfähige Modelle gedient. Diese können jedoch die physiologische Komplexität menschlicher Gewebe nicht exakt wiedergeben 8,13,14. Infolgedessen werden 3D-Kultursysteme mit immer besseren Verbesserungen entwickelt, um die physiologische Komplexität sowohl von gesundem als auch von erkranktem Darmgewebe als Risikobewertungs-Toolboxen der nächsten Generation zu rekapitulieren 13,14. Zu diesen Modellen gehören 3D-Transwell-Gerüste mit verschiedenen Zelllinien, Organoidkulturen und mikrofluidischen Geräten (Intestine-on-Chip), die sowohl Zelllinien als auch Organoide (sowohl aus gesundem als auch aus erkranktem Gewebe) verwenden8,13,14.
Das in der vorliegenden Studie vorgestellte 3D-Protokoll für "gesundes Gewebe" basierte auf der Suche nach einem Gleichgewicht zwischen physiologischer Komplexität und experimenteller Einfachheit13. Das Modell ist repräsentativ für ein 3D-Transwell-Gerüst, das aus drei Zelllinien besteht (Enterozyten [die Goldstandard-Caco-2-Linie des Kolon-Adenokarzinoms] mit einer unterstützenden Immunkomponente [U937-Monozyten und L929-Fibroblasten]), die ein standardisiertes und leicht wiederholbares System darstellen, das für das vorläufige Screening von Nahrungsmolekülen von Interesse auf die Integrität der Darmepithelbarriere und die Immunantwort anwendbar ist. Das Protokoll umfasst Paraffineinbettungen zur lichtmikroskopischen Beurteilung der Integrität der Epithelbarriere unter Verwendung von fixierten Darmäquivalenten. Der Vorteil des vorliegenden Ansatzes besteht darin, dass zahlreiche Abschnitte des eingebetteten Gewebes in einem einzigen Experiment für mehrere Parameter gefärbt werden können.

basic three-dimensional (3d) intestinal model system with an immune component

Die Verwendung von In-vivo - und In-vitro-Darmmodellen zur Untersuchung der Pathophysiologie entzündlicher Darmerkrankungen, zum pharmakologischen Screening potenziell nützlicher Substanzen und zur Toxizitätsuntersuchung potenziell schädlicher Lebensmittelbestandteile hat zugenommen. Relevant ist, dass derzeit ein Bedarf an der Entwicklung von zellbasierten In-vitro-Modellen besteht, um Tiermodelle zu ersetzen. Hier wird ein Protokoll für ein grundlegendes, dreidimensionales (3D) intestinales Äquivalentmodell aus "gesundem Gewebe" unter Verwendung von Zelllinien vorgestellt, das sowohl experimentelle Einfachheit (standardisiertes und leicht wiederholbares System) als auch physiologische Komplexität (Caco-2-Enterozyten mit einer unterstützenden Immunkomponente von U937-Monozyten und L929-Fibroblasten) bietet. Das Protokoll beinhaltet auch eine Paraffineinbettung zur lichtmikroskopischen Auswertung von fixierten Darmäquivalenten, wodurch der Vorteil der Analyse mehrerer visueller Parameter in einem einzigen Experiment geboten wird. Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte (H&E)-gefärbte Schnitte, die zeigen, dass die Caco-2-Säulenzellen eine dichte und regelmäßige Monoschicht in Kontrollbehandlungen bilden, werden verwendet, um die Wirksamkeit des Modells als experimentelles System zu überprüfen. Zu den Parametern, die aus den Schnitten analysiert wurden, gehören eine reduzierte Monoschichtdicke sowie eine Störung und Ablösung von der zugrunde liegenden Matrix (H&E), eine verminderte Expression von Tight-Junction-Proteinen, wie sie aus der Occludin-Färbung (statistisch quantifizierbar) hervorgeht, und die Immunaktivierung migrierender U937-Zellen, wie sie durch die Cluster-of-Differentiation 14 (CD14)-Färbung und die CD11b-bezogene Differenzierung in Makrophagen nachgewiesen wird. Wie die Verwendung von Lipopolysaccharid zur Simulation einer Darmentzündung zeigt, sind zusätzliche Parameter, die gemessen werden können, eine erhöhte Schleimfärbung und Zytokinexpression (z. B. Midkin), die vor der Fixierung aus dem Medium extrahiert werden können. Das grundlegende dreidimensionale (3D) Darmschleimhautmodell und die fixierten Schnitte können für Studien zum Entzündungsstatus und zur Barriereintegrität empfohlen werden, wobei die Möglichkeit besteht, mehrere visuell quantifizierbare Parameter zu analysieren.

The intestinal epithelial barrier, a one-cell-thick internal lining containing different types of epithelial cells, constitutes the first physical defensive barrier or interface between the outside and the internal milieu of the body1,2. Columnar-type enterocytes constitute the most abundant type of epithelial cells. These are&#160;responsible for maintaining epithelial barrier integrity through interactions between several barrier components, including tight junctions (TJs), playing a significant role in barrier tightening1,3. The TJ structure consists of intracellular plaque proteins, such as zonula occludens (ZO) and cingulin, cooperating with transmembrane proteins, including occludins, claudins, and junctional adhesion molecules (JAMs) that form zipper-like structure tightly linking the neighboring cells3,4. The transmembrane proteins regulate the passive paracellular diffusion of small compounds and exclude toxic large molecules.
Potentially toxic food compounds and food contaminants stimulate inflammatory cytokine production that disrupts the epithelial permeability, activating immune cells and causing chronic intestinal tissue inflammation5,6,7. In contrast, various anti-oxidant and anti-inflammatory phytochemicals have been reported to reduce inflammatory cytokine expression and enhance intestinal TJ barrier integrity through the restoration of TJ protein expression and assembly4,6,8. Hence, the regulation of epithelial barrier integrity by both beneficial and harmful compounds has seen an increase in the use of both in vivo and in vitro models aimed at mimicking the intestinal barrier for pharmaceutical screening and toxicity studies. This is particularly relevant given the increasing interest in understanding the pathophysiology of intestinal bowel diseases (IBD), necrotizing enterocolitis, and cancer, which can be simulated in experimental models8,9,10.
There has been a demand for the development of cell-based in vitro models in order to achieve the objective of the &#8220;3Rs&#8221; in animal testing. These include replacement alternatives to the use of animals, reduction in the number of animals used, and refinement in adopting methods that alleviate distress11,12,13. Moreover, the underlying molecular, cellular, and physiological mechanisms between human and murine models (rodents being the most widely used species) are distinctive, leading to controversy regarding the efficacy of the murine models as predictors in human responses12,13. Numerous advantages of in vitro human cell-line models include target-restricted experimentation, direct observation, and continuous analysis13.
Single-cell-type monolayers in two-dimensional (2D) cultures have served as powerful models. However, these cannot precisely reproduce the physiological complexity of human tissues8,13,14. As a result, 3D&#160;culture systems are being developed with ever-increasing improvements to recapitulate the physiological complexity of both healthy and diseased intestinal tissues as next-generation risk assessment toolboxes13,14. These models include 3D Transwell scaffolds with diverse cell lines, organoid cultures, and microfluidic devices (intestine-on-chip) using both cell lines and organoids (derived from both healthy and diseased tissues)8,13,14.&#160;
The 3D &#8220;healthy tissue&#8221; intestinal equivalent protocol presented in the present study was based on striking a balance between physiological complexity and experimental simplicity13. The model is representative of a 3D Transwell scaffold, comprised of three cell lines (enterocytes [the gold-standard colon adenocarcinoma Caco-2 line] with a supporting immune component [U937 monocytes and L929 fibroblasts]), constituting a standardized and easily repeatable system applicable for the preliminary screening of dietary molecules of interest on intestinal epithelial barrier integrity and immune response. The protocol includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of epithelial barrier integrity using fixed intestinal equivalents. The advantage of the present approach is that numerous sections of the embedded tissues can be made to stain for multiple parameters from a single experiment.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung der Auswirkungen von Verbindungen auf das Darmgewebe mit Hilfe von 3D-Modellen menschlicher Zelllinien 

Grundlegendes dreidimensionales (3D) Darmmodellsystem mit einer Immunkomponente

The scope of the work is to use these in vitro three-dimensional human cell line models to investigate the fact of beneficial as well as helpful compounds on intestinal tissue. The models can be used to further research understanding and also as a basic drug model. Using the plant-derived compounds, spermidine and eugenol, both separately and together in supplement form, we measure beneficial increases in autophagy and decreases in inflammation using these models.Then we will also able to show the potentially harmful effect of gluten extracted from certain wheat varieties on intestinal tissues. We are currently using economically priced, standardized, and easily repeatable in vitro system that better reflect the physiology of the human intestine as an alternative to animal models. Since we also use commercial human cell line rather than plant-derived cells, the responses from the study are more applicable to the general population.The protocol is based entirely on the use of different lines. These renders the model most standardized and reproducible. Furthermore, the simultaneous cultivation of different cell lines, enterocytes, fibroblasts, and immune system cells, allows for cellular responses that are closer to what happens in the patient.

Der erste wichtige Aspekt besteht darin, die Akzeptanz der basischen 3D-Darmäquivalent-Schleimhaut für experimentelle Zwecke zu bestimmen. Dies wird mit der am weitesten verbreiteten Färbung in Histologie- und Histopathologielabors durchgeführt, nämlich Hämatoxylin (färbt Kernmaterial tiefblau-violett) und Eosin (färbt zytoplasmatisches Material in verschiedenen Rosatönen). Die H&E-Färbung wird zunächst an einer unbehandelten Kontrolle durchgeführt, die unter den gleichen Bedingungen und im gleichen Zeitrahme...

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Hier beschreiben wir die Konstruktion eines grundlegenden dreidimensionalen (3D) intestinalen Zelllinienmodellsystems und eines Paraffin-Einbettungsprotokolls für die lichtmikroskopische Bewertung von fixierten intestinalen Äquivalenten. Die Färbung ausgewählter Proteine ermöglicht die Analyse mehrerer visueller Parameter aus einem einzigen Experiment für den potenziellen Einsatz in präklinischen Wirkstoff-Screening-Studien.

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the ...

Ziel der Arbeit ist es, diese in vitro dreidimensionalen humanen Zelllinienmodelle zu verwenden, um die Tatsache von nützlichen und hilfreichen Verbindungen auf Darmgewebe zu untersuchen. Die Modelle können zur weiteren Erforschung des Verständnisses und auch als grundlegendes Arzneimittelmodell verwendet werden. Unter Verwendung der pflanzlichen Verbindungen Spermidin und Eugenol, sowohl einzeln als auch zusammen in Form von Nahrungsergänzungsmitteln, messen wir mit diesen Modellen einen positiven Anstieg der Autophagie und einen Rückgang der Entzündung.Dann können wir auch die potenziell schädliche Wirkung von Gluten, das aus bestimmten Weizensorten gewonnen wird, auf das Darmgewebe zeigen. Wir verwenden derzeit kostengünstige, standardisierte und leicht wiederholbare In-vitro-Systeme, die die Physiologie des menschlichen Darms als Alternative zu Tiermodellen besser widerspiegeln. Da wir auch kommerzielle menschliche Zelllinien anstelle von pflanzlichen Zellen verwenden, sind die Antworten aus der Studie eher auf die Allgemeinbevölkerung anwendbar.Das Protokoll basiert vollständig auf der Verwendung verschiedener Leitungen. Dadurch wird das Modell am standardisiertesten und reproduzierbarsten. Darüber hinaus ermöglicht die gleichzeitige Kultivierung verschiedener Zelllinien, Enterozyten, Fibroblasten und Zellen des Immunsystems zelluläre Reaktionen, die dem im Patienten näher kommen.

basic-three-dimensional-3d-intestinal-model-system-with-an-immune

Research

JoVE Journal

Biology

Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component

718 Aufrufe.  Alma Mater Studiorum-University of Bologna. Ziel der Arbeit ist es, diese in vitro dreidimensionalen humanen Zelllinienmodelle zu verwenden, um die Tatsache von nützlichen und hilfreichen Verbindungen auf Darmgewebe zu untersuchen. Die Modelle können zur weiteren Erforschung des Verständnisses und auch als grundlegendes Arzneimittelmodell verwendet werden. Unter Verwendung der pflanzlichen Verbindungen Spermidin und Eugenol, sowohl einzeln als auch zusammen in Form von Nahrungsergänzungsmitteln, messen wir mit diesen Modellen einen...

Serie: Autor im Rampenlicht: Untersuchung der Auswirkungen von Verbindungen auf das Darmgewebe mit Hilfe von 3D-Modellen menschlicher Zelllinien 

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the pharmacological screening of potentially beneficial substances, and for toxicity studies on potentially harmful food components. Of relevance, there is a current demand for the development of cell-based in vitro models to substitute animal models. Here, a protocol for a basic, &#8220;healthy tissue&#8221; three-dimensional (3D) intestinal equivalent model using cell lines is presented with the dual benefit of providing both experimental simplicity (standardized and easily repeatable system) and physiological complexity (Caco-2 enterocytes with a supporting immune component of U937 monocytes and L929 fibroblasts). The protocol also includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents, thereby providing the advantage of analyzing multiple visual parameters from a single experiment. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) stained sections showing the Caco-2 columnar cells forming a tight and regular monolayer in control treatments are used to verify the efficacy of the model as an experimental system. Using gluten as a pro-inflammatory food component, parameters analyzed from sections include reduced monolayer thickness, as well as disruption and detachment from the underlying matrix (H&#38;E), decreased tight junction protein expression as shown from occludin staining (quantifiable statistically), and immune-activation of migrating U937 cells as evidenced from the cluster of differentiation 14 (CD14) staining and CD11b-related differentiation into macrophages. As shown by using lipopolysaccharide to simulate intestinal inflammation, additional parameters that can be measured are increased mucus staining and cytokine expression (such as midkine) that can be extracted from the medium prior to fixation. The basic three-dimensional (3D) intestinal mucosa model and fixed sections can be recommended for inflammatory status and barrier integrity studies with the possibility of analyzing multiple visual quantifiable parameters.

Here we describe constructing a basic three-dimensional (3D) intestinal cell line model system and a paraffin embedding protocol for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents. Staining of selected proteins permits the analysis of multiple visual parameters from a single experiment for potential use in preclinical drug screening studies.

Forschung

Biologie

Preparation of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Microscopic Evaluation of Fixed Intestinal Equivalents

To begin, select a 24-well plate containing inserts with 0.4 micron filters. Using a pipette, add 500 microliters of HBSS below and above the filter inserts. Then close the multi-well plate and place it in an incubator for two hours.After incubation, carefully aspirate the HBSS from the plate. Prepare a cell-free collagen solution in a sterile 50 milliliter tube in DMEM on ice. Add 250 microliters of collagen above the membrane filter and place the lid on the plate.Allow the solution to polymerize at room temperature. Next, remove the L-929 fibroblast cell culture from the incubator. Add two milliliters of a pre-warmed trypsin EDTA solution to the flask and place it in an incubator for three to five minutes.Transfer the cell suspension to a sterile 15 milliliter tube and centrifuge at 645 G for five minutes. Using a vacuum pump, aspirate the supernatant and resuspend the pellet in one milliliter of DMEM. Add 20 microliters of cell suspension into a tube containing 20 microliters of Trypan Blue solution.And use a cell counting chamber to evaluate the cell density. Next, remove the U-937 monocyte cell culture from the incubator. Centrifuge the cell suspension and resuspend the pellet in one milliliter of RPMI.After ensuring cells are homogeneously suspended, count them using a cell counting chamber. Next, prepare cell suspensions containing 50, 000 L-929 and 15, 000 U-937 cells respectively in 50 microliters of DMEM. Add each 50 microliter cell suspension to 450 microliters of collagen and mix thoroughly.Overlay the pre-coded cell-free lamina propria with 500 microliters of the collagen cell solution. Close the plate and place it in an incubator for two hours to allow the solution to set. Next, remove the Caco-2 cell culture from the incubator.Using a vacuum pump, aspirate the medium and rinse the cells with 10 milliliters of PBS. Add five milliliters of PBS trypsin EDTA solution and place it in an incubator for five to eight minutes. Then centrifuge the cell suspension and resuspend the pellet in one milliliter of DMEM.After counting, prepare a cell suspension containing 150, 000 Caco-2 cells in 50 microliters of DMEM. Place the plate in a laminar flow hood for 10 minutes before transferring it to the incubator. After 30 minutes, add 500 microliters of the DMEM above the reconstructed model and 500 microliters below the filter and return the plate to the incubator.The next day, carefully replace the medium with 500 microliters of fresh DMEM above and below the filter respectively.

Erstellung eines einfachen 3D-rekonstruierten Darmschleimhautmodells zur mikroskopischen Beurteilung von fixierten Darmäquivalenten

Paraffin Embedding of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Immune-Histochemical Staining

For paraffin embedding of cells, set the paraffin machine to 58 degrees Celsius. Using pliers, transfer the membrane inserts to clean wells of a sterile 24-well plate. Add 500 microliters of 37%buffered formalin and PBS above the filter, and one milliliter below the filter.Close the lid and leave the plate in a fume hood for two hours. Once the lamina propria is detached from the membrane insert, transfer the intestinal mucosa into a beaker containing 25 milliliters of 35%ethanol, and incubate for 10 minutes. After dehydration in increasing ethanol concentrations, place the samples in 50 milliliters of xylene or a histological clearing agent for 10 to 20 minutes.Once the samples are transparent, place them in a metal tissue cassette holder and submerge them in liquid paraffin inside a heated machine. After 45 minutes, use a microtome to cut four micron sections. Place the cut section on the slides and dry them in an oven at 37 degrees Celsius for 24 hours.An acceptable 3-D intestinal equivalent mucosa model consists of Caco-2 cells formed in a tight and regular monolayer above the extracellular-matrix-rich lamina propria. Unacceptable models include those showing excessive growth, disorganized epithelial layers, malformation or lack of epithelial layer formation. The proinflammatory effect of wheat protein with a high gluten content disrupted the cellular monolayer and reduced the thickness of the epithelial layer compared to the control group.The occludin protein content was significantly higher in the control group than in the group exposed to gluten protein. CD14 and CD11b staining of U937 monocytes showed that wheat protein with a high gluten content activated the monocytes, and induced their migration and differentiation into macrophages. Under the lipopolysaccharide challenge, Caco-2 cells increased mucus production and the release of the inflammatory marker midkine.