El cultivo 3D hace que sea más difícil medir la función celular, utilizando ensayos biológicos estándar. Este protocolo permite la medición de la actividad celular y somática sin más procesamiento de muestras, utilizando un sensor fluorescente y un lector de microplacas estándar. Este protocolo permite una serie de nuevas aplicaciones, incluida la detección de fármacos de alto rendimiento.
Además, el sensor fluorescente se puede intercambiar con un sensor diferente para medir otras proteasas o funciones celulares. Es importante planificar cuidadosamente el experimento con antelación, completar todos los cálculos para la preparación del hidrogel y configurar todos los equipos y reactivos para minimizar el tiempo que las células están en suspensión. Para empezar, preparar el medio de ensayo con 1%carbón despojado De Serum Bovino Fetal, dos mM L-glutamina, 10 unidades por ml de penicilina, y 10 microgramos por ml de estreptomicina.
No utilice medios rojos fenol, que tienen más interferencia de fluorescencia. Para realizar controles positivos, añada la enzima de colágeno bacteriada tipo uno al medio de ensayo a concentraciones de 10 y 1000 microgramos por ml. A continuación, preparar la solución precursora de hidrogel añadiendo los reactivos a un tubo de 1,5 ml.
Asegúrese de vórtice después de la adición de cada componente. A continuación, divida la solución en varios tubos de 1,5 ml para diferentes condiciones. Para encapsular las células en hidrogeles, primero prepare una suspensión de una sola célula lavando un plato de 10 cm de células de melanoma A375 con 10 ml de PBS.
Luego, agrega 0.05%trypsin al plato, para probar las células. Incubar el plato a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, durante tres minutos. Después de la incubación, cuente las células con un hemocicómetro.
A continuación, centrifugar la solución celular a 314 veces G durante tres minutos. Aspirar los medios de cultivo y resuspend células en el búfer PBS aproximadamente tres veces la densidad encapsulada final. Cuente las células de nuevo para asegurar una concentración celular precisa.
Luego, agregue las células suspendidas en PBS a cada tubo de la solución precursora de hidrogel de acuerdo con la densidad de siembra requerida, y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Para condiciones controladas, agregue solamente PBS y vórtice. A continuación, pipetear 10 microlitros de la solución precursora de hidrogel en el centro de cada pozo de una placa estéril, negra, de fondo redondo de 96 pozos.
Inspeccione visualmente la colocación de los hidrogeles dentro de los pozos. Los hidrogeles no centrados se pueden reposicionar utilizando una punta de pipeta antes de la polimerización. Para polimerizar la solución precursora de hidrogel, exponga la placa a la luz UV a 4 milivatios por centímetro cuadrado, durante tres minutos.
A continuación, añada 150 microlitros de los medios de ensayo a todos los pozos que contengan células encapsuladas, y 150 microlitros de la solución enzimática de colagenasa a los pozos de controles positivos. Añadir 150 microlitros de tampón PBS a los pozos exteriores de la placa para reducir la evaporación durante la incubación. Utilice un lector de microplacas para medir la intensidad fluorescente de la placa a la hora cero, inmediatamente después de la encapsulación.
Seleccione el protocolo de placa de pozo opaco 96 con excitación de 494 nanómetros y longitudes de onda de emisión de 521 nanómetros. A continuación, incubar la placa a 37 grados centígrados en un 5% de dióxido de carbono, durante 18 horas. A continuación, agregue reactivos de actividad metabólica a una relación de volumen a volumen de uno a 10 por pozo para todas las condiciones y controles.
Incubar la placa en 37 grados Centígrados, 5% dióxido de carbono, durante seis horas. Finalmente, medir la intensidad fluorescente de la placa a las 24 horas, post encapsulación. Seleccione el protocolo de placa de pozo opaco de 96, con 494 longitudes de excitación de nanómetros y longitudes de onda de emisión de 521 nanómetros, para la actividad de MMP.
Para medir la actividad metabólica, seleccione la excitación de 560 nanómetros y las longitudes de onda de emisión de 590 nanómetros. En este estudio, tras la exposición del sensor fluorogénico a la proteasa adecuada, se separan el quencher y el fluoróforo, y aumenta la fluorescencia. Las mediciones de fluorescencia de los hidrogeles incubados con enzima de colágeno bacteriano tipo uno, muestran que la señal más baja detectada fue producida por controles negativos, sin colagenasa.
Mientras que la señal más alta detectada fue producida por 1000 microgramos por ml de colagenasa o superior, cuando la señal comienza a meseta. El rango de trabajo calculado fue de aproximadamente 0,16 a 474 microgramos por ml de colagenasa. Las lecturas de fluorescencia para la línea celular de melanoma A375, encapsuladas en un rango de densidades justo después de la encapsulación, eran bajas a través de densidades de siembra, y similares a los geles de control sin células como se esperaba.
24 horas después de la encapsulación, la actividad MMP fue directamente proporcional a la densidad de siembra, y las densidades de siembra en o más de 1 millón de células por ml, están dentro de los límites del rango de trabajo. Las mediciones de actividad metabólica de la línea celular A375, también fueron directamente proporcionales a la densidad de siembra celular. Al normalizar la actividad de MMP a la actividad metabólica, no hubo diferencia significativa en la actividad de MMP por célula a densidades de siembra superiores a 2 millones de células por ml.
Las técnicas adecuadas de pipeteo son importantes. Esto incluye consejos de pre-humectación para lograr volúmenes precisos de soluciones viscosas. Además, centrar la solución precursora de hidrogel dentro del pozo, es fundamental para lograr mediciones precisas por parte del lector de placas.
Para identificar MMP específicos que contribuyen a la actividad MMP medida aquí, se podrían utilizar ensayos de expresión como western blot o PCR. El uso de células vivas requiere un procedimiento adecuado de bioseguridad, una técnica aséptica y un gabinete de seguridad biológica. La luz UV es peligrosa, utilice un escudo para proteger al usuario y no mire directamente a la luz.
