Los autores desean agradecer al Dr. David Tirrell (Caltech), por su amable donación del plásmido pQE9 AC 10 ATRP 12, el Dr. Tom Muir (Universidad de Princeton) por su amable donación del plásmido kanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, Dr. Takehisa Matsuda (Kanazawa Institute of Technology, Hakusan, Ishikawa, Japón) por su amable donación del plásmido pET30-cuta-Tip1 10, y el Dr. Jay D. Keasling (UC Berkley) por su amable donación del plásmido pJD757 13 . Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Nacional de Ciencias CARRERA, EE.UU. Fuerza Aérea YIP y Programa de Investigación Avanzada Hackman Norman.

1. Construcción de plásmidos NOTA: Todos los genes fueron amplificados bajo reacciones de PCR utilizando Phusion de alta fidelidad de ADN polimerasa según las especificaciones del fabricante. Los cebadores usados ​​para la clonación se han descrito anteriormente 9. Todos los constructos se enumeran en la Tabla 1. <ol><li> Para generar Cuta-NpuN (N, Tabla 1): <ol><li> Amplificar por PCR los genes Cuta y NpuN de plásmidos pET30-cuta-Tip1 10 y kanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, respectivamente, utilizando los cebadores apropiados. </li><li> Digerir estos fragmentos con las enzimas de restricción apropiadas y secuencialmente insertar estos fragmentos en el vector pET26b entre el promotor T7 y una etiqueta 6xHistidine C-terminal para generar N (Figura 2A). </li></ol></li><li> Para generar NPUC-S-cuta (C, Tabla 1): <ol><li> PCR amplificar NPUC, Cuta y S fragmentaciónt [AG 3 (PEG)] 10 del plásmido kanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, pET30-cuta-Tip1 10 y pQE9 AC 10 ATRP 12, respectivamente, utilizando los cebadores apropiados. </li><li> Digerir estos fragmentos con las enzimas de restricción apropiadas y secuencialmente insertar estos fragmentos en el vector pET26b entre el promotor T7 y un 6xHistidine C-terminal para generar C (Figura 2B). </li></ol></li><li> Para generar NPUC-S-SH3 lig-cuta (lig C-SH3, Tabla 1): <ol><li> Amplificar por PCR utilizando cebadores Cuta contienen un lig SH3 (PPPALPPKRRR) y un conector flexible (GGGGS) 2 para generar un fragmento SH3 lig-cuta. </li><li> Vuelva a colocar el gen Cuta de C con el fragmento SH3 lig-cuta. </li></ol></li><li> Para generar SH3-GFP (Tabla 1): <ol><li> Amplificar el gen SH3 del plásmido pJD757 13 utilizando elcebadores apropiados. </li><li> Fusible este fragmento con el gen GFP y la inserta en el vector pET26b entre el promotor T7 (Figura 2 C) y una etiqueta 6xHistidine C-terminal. </li></ol></li></ol> 2. Expresión de Proteínas <ol><li> Transformar 50 l de químicamente competente de Escherichia coli BL21 (DE3) con el plásmido de expresión apropiado. </li><li> Después de la transformación, en serie diluir estas células, y la placa de ellos en medio Luria-Bertani (LB) / placas de agar que contienen 50 mg / ml de kanamicina. </li><li> Incubar las placas que contienen células transformadas a 37 ° C durante ~ 15 horas. </li><li> Después de la incubación, recoger una placa que contiene 50 a 100 colonias y volver a suspender todas las colonias en 5 ml de caldo LB. </li><li> Suspensión de transferencia a 1 L de caldo LB que contenía kanamicina (50 mg / ml) y crecer las células a 37 ° C con agitación a 250 rpm. Supervisar la absorbancia a 600 nm (OD 600). Cultive hasta OD 600 ~ 0,8. <ol><li> Para C y C-SH3 LIG, inducir la expresión de la proteína mediante la adición de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) al cultivo (1 mM de concentración final) y se incuba el cultivo a 37 ° C durante 4 horas mientras se agitaba a 250 rpm. </li><li> Para N y SH3-GFP, enfriar la cultura a ~ 18 ° C por inmersión del matraz de cultivo en un baño de agua con hielo durante ~ 5 min. Inducir la expresión de proteínas mediante la adición de IPTG al cultivo (concentración final 1 mM) y se incuba el cultivo a 18 ° C durante 14-18 horas con agitación a 250 rpm. </li></ol></li><li> Después de la expresión de proteínas, centrifugar el cultivo a 6000 xg durante 20 min a 4 ° C para recoger el sedimento. Sedimento celular Almacenar a -80 ° C hasta su uso. </li></ol> 3. Protein Purification <ol><li> Purificación de N (condiciones de desnaturalización) <ol><li> Resuspender los sedimentos celulares en tampón A (Tabla 2) en 10 ml / g de sedimento húmedo. </li><li> Immerse la suspensión de pellets en un baño de hielo-agua y romper las células por sonicación (Amp 10, con 1 pulso segundos y 6 segundos de pausa durante 1 min). </li><li> Centrifugar el lisado a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante. Resuspender el sedimento en Tampón de DA (que contiene 8 M de urea) y se centrifuga la suspensión a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Pasar el sobrenadante a través de un 5 ácido Ni-nitrilotriacético ml (NTA) columna previamente equilibrada con tampón DA. </li><li> Lavar la columna con 30 ml de Tampón DA suplementado con imidazol 45 mM. Eluir la proteína purificada utilizando 20 ml de Tampón DA suplementado con imidazol 150 mM. </li><li> Reducir la concentración de urea en la muestra de proteína a &lt;1 mM ya sea por uno de los siguientes métodos dados en 3.1.7.1 o 3.1.7.2: <ol><li> Se dializa la proteína en tampón DPBS (Tabla 2) a 4 ° C durante la noche utilizando tubos con &lt;20 kDa de corte. </li><li> Centrífuga purificado proteínas en un 30 &amp; #160; columna de centrifugación de ultra-filtración kDa a 2800 xg, 4 ° C hasta que el volumen es menos de 1 ml. Añadir tampón de 14 ml de DPBS a la columna para diluir la muestra de proteína. Repetir la centrifugación / dilución pasos tres veces más. </li></ol></li><li> Después de intercambio de tampón, añadir ditiotreitol (DTT) a la proteína purificada (final de 2 mM) y concentrado de proteína de ~ 100 mg / ml mediante centrifugación a través de una columna de centrifugación de ultra-filtración 30 kDa a 2800 xg, 4 ° C. </li><li> Alícuota de la proteína concentrada y se almacenan a -80 ° C hasta su uso. </li></ol></li><li> Purificación de C y C-SH3 lig (condición nativa) <ol><li> Resuspender los sedimentos celulares en tampón B (pH 6,0) (Tabla 2) suplementado con 1x cóctel inhibidor de proteasa a 10 ml / g de sedimento húmedo. Utilizar una solución tampón ácida para minimizar la degradación proteolítica de la proteína diana. </li><li> Disrupt suspensión celular por sonicación como se describe en 3.1.2. Centrifugar las Lyscomió a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C y mantener el sobrenadante. </li><li> Pasar el lisado soluble a través de una columna de 5 ml de Ni-NTA equilibrada previamente con tampón B. </li><li> Lavar la columna con Tampón B suplementado con imidazol 45 mM, y eluir la proteína diana en 20 ml de tampón B complementado con imidazol 150 mM. </li><li> Para C, vaya al paso 3.2.6. Para C-SH3 lig, llevar a cabo un paso adicional de purificación de intercambio iónico para eliminar la proteína parcialmente degradado como se indica en los pasos 3.2.5.1 a 3.2.5.3 <ol><li> Reducir la concentración de NaCl en C-SH3 LIG a &lt;1 mM siguiendo el procedimiento descrito en 3.1.7. </li><li> Carga de la proteína diana en una columna de matriz de 5 ml de aniones de cuentas intercambiador de agarosa previamente equilibrada con tampón de fosfato de sodio (50 mM, pH 7,0). </li><li> Proteína diana eluyen de la columna mediante la ejecución de un gradiente de una solución que contenía Tris-HCl 10 pH 8,0 Buffer para una solución que contiene el mismo tampón suplementado con 1 M de NaCl. Tomar muestras durante la elución de proteínas y las muestras de la piscina con la más alta pureza basado en sodio dodecil sulfato de electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). </li></ol></li><li> Intercambio de tampón de la proteína purificada en tampón DPBS, como se describe en 3.1.7. </li><li> Añadir DTT a la proteína purificada (concentración final 2 mM) y concentrar la proteína a ~ 100 mg / ml utilizando una columna de centrifugación de ultra-filtración 30 kDa como se describe en 3.1.8. Alícuota y almacenar concentrados de proteínas a -80 ° C hasta su uso. </li></ol></li><li> La purificación de SH3-GFP <ol><li> Resuspender los sedimentos celulares usando tampón A a 10 ml / g de sedimento húmedo. </li><li> Interrumpir la suspensión de pellets por sonicación como se describe en 3.1.2. </li><li> Centrifugar el lisado a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C y recoger el sobrenadante. </li><li> Pasar el sobrenadante (lisado soluble) a través de una columna de 5 ml de Ni-NTA equilibrada previamente conTampón A. </li><li> Lavar la columna con 30 ml de tampón A suplementado con imidazol 45 mM. Eluir la proteína purificada utilizando 20 ml de tampón A suplementado con imidazol 150 mM. </li><li> Intercambio de tampón de la proteína purificada en tampón DPBS usando un enfoque similar al que se describe en 3.1.7 y concentrar la proteína a ~ 150 mg / ml usando una columna de centrifugación de ultra-filtración 30 kDa como se describe en 3.1.8. </li><li> Alícuota y almacenar la proteína purificada a -80 ° C hasta su uso. </li></ol></li><li> El análisis de SDS-PAGE de muestras purificadas que contienen CUTA <ol><li> Diluir cada proteína purificada en agua doblemente destilada para reducir la concentración de NaCl a ~ 1 mM. A esta concentración de NaCl, la mayor parte de las proteínas trímeros CUTA ejecutar como monómeros en los geles de SDS-PAGE. </li><li> Mezclar muestras con 2x tampón de muestra SDS (0,5 M de Tris-HCl, pH 6,8, 20% de glicerol, 10% w / v de SDS, 0,1% w / v-bromo fenol azul, 2% β-mercaptoetanol), se incubaron a 95 ° C durante 5 min. </li><li> Cargue el sammuestras en un gel de SDS-PAGE al 12%. Llevar a cabo la electroforesis a un voltaje constante de 200 V durante ~ 50 min. </li><li> Observar la proteína en los geles mediante tinción con azul brillante de Coomassie R250 siguiendo los protocolos estándar (Figura 1C). </li></ol></li></ol> 4. Formación de hidrogel NOTA: los hidrogeles de muestras hechas en este estudio contienen 1,6 mM de cada bloque de construcción de hidrogel a menos que se indique lo contrario. Esta concentración de proteína se obtiene un hidrogel suave y estable. PRECAUCIÓN: La azida de sodio (NaN3) se añade al hidrogel hasta una concentración final de 0,5% w / v para evitar la contaminación bacteriana. NaN 3 es altamente tóxica y debe manejarse con sumo cuidado, como se indica en la Hoja de Datos de Seguridad. <ol><li> Calcular el volumen de cada una de las proteínas concentradas necesarios para alcanzar una concentración final de 1,6 mM en un hidrogel 100 l de muestra. Por ejemplo: Concentración de N:100 mg / ml Peso molecular de N: 26,3 kDa (consulte la Tabla 1) Concentración 100 l deseado:: Volumen deseado 1,6 mM <img alt="" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" width="600" /></li><li> Para hacer un hidrogel 100 l (1,6 mM), mezclar C (x l, volumen calculado de acuerdo a 4,1) con 5% de NaN 3 (10 l), 100 mM de DTT (5 l) y N (Y l, volumen calculado según 4.1) dentro de un vial de vidrio de 2 ml. </li><li> Añadir tampón DPBS ((85 - x - y) l) al vial para alcanzar un volumen final de 100 l, y mezclar manualmente todos los componentes a través de un movimiento de torbellino usando una punta de pipeta. Nota: La solución se vuelve muy viscoso tras la mezcla. </li><li> Centrifugar la mezcla durante 2 min a 8000 xg para eliminar las burbujas de aire. </li><li> Incubar la mezcla a la habitacióntemperatura durante la noche para permitir que la reacción inteína trans-empalme para llegar a la terminación. Confirme la formación del hidrogel por sonda girando al revés. Las proteínas no fluirá si se forma un hidrogel. </li><li> Estimar el rendimiento inteína trans-empalme mediante la comprobación de muestras (0,5 mu l cada uno) recogidos antes del paso 4.2 y después de la etapa 4.5 en un gel de SDS-PAGE, como se describe en 3.4 (Figura 1C). </li></ol> 5. La inmovilización de las buenas prácticas agrarias a través de proteínas Docking (DP) y la estación de acoplamiento de péptidos (DSP) Interacción <ol><li> Para hacer una 50 l de hidrogel de GFP-funcionalizado (1,2 mM), se combinan C-SH3 LIG (x l, calculado de acuerdo con 4.1) y SH3-GFP (l Y, calculado de acuerdo con 4,1) en una relación molar 1:1 en un 1,7 tubo de microcentrífuga ml y se incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Añadir 5% NaN 3 (5 l), DTT 100 mM (2,5 l), (42,5 - x - &lt;em&gt; y) mu l DPBS al mismo tubo. Añadir N (Y l, calculado de acuerdo a 4,1) para alcanzar una relación molar 1:1 de N y C-SH3 LIG. Mezclar la muestra mediante el uso de una punta de pipeta por un movimiento giratorio. </li><li> Centrifugar la mezcla a 8000 xg durante 2 min y se incuba la mezcla a temperatura ambiente durante la noche en la oscuridad. Un hidrogel encapsular formas SH3-GFP durante la incubación. </li></ol> 6. El uso de 1,6 mM de hidrogel como un andamio para la inmovilización reacción enzimática en Disolvente orgánico <ol><li> Utilice el HRP como enzima modelo. Preparar una solución madre de HRP (28 mg / ml o 0,63 mM) en DPBS. </li><li> Para hacer una 30 l de hidrogel (1,6 mM) atrapando HRP, combinan C (x l, calculado de acuerdo con 4.1) con HRP (2 l), 5% de NaN 3 (3 l) y DTT (1,5 l de 100 mM) dentro de un tubo de centrífuga de 1,7 ml. </li><li> Añadir N (y &lt;/ Em&gt; l, calculado de acuerdo con 4.1) y DPBS (23,5 - x - y) l. Mezclar con una punta de pipeta con un movimiento giratorio. </li><li> Centrifugar la mezcla a 8000 xg durante 2 min y se incuba a temperatura ambiente durante la noche. PRECAUCIÓN: los regentes utilizados para el siguiente ensayo de actividad son altamente tóxicos. Utilice las recomendaciones de seguridad específicas de las correspondientes fichas de datos de seguridad de materiales. </li><li> Para la reacción enzimática, sumergir el hidrogel en 1 ml de cóctel de reacción que contiene N, diamina N-dimetil-p-fenileno (5,8 mM), fenol (5,8 mM) e hidroperóxido de terc-butilo (2,9 mM) en n-heptano 14. Interrumpir manualmente el gel usando una punta de pipeta para aumentar el área de superficie de contacto del hidrogel y el disolvente. </li><li> Detectar producto HRP, un tinte de tipo indofenol, mediante la medición de la absorbancia óptica de las muestras tomadas en diferentes momentos a 546 nm en un lector de placas (Figura 5). </li> &lt;/ Ol&gt;

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No existen intereses financieros en competencia.

En este trabajo, hemos demostrado la síntesis de una gran estabilidad de hidrogel de proteína intein mediada. El uso de una fracción de inteína permite el hidrogel que se forme condicionalmente en respuesta a la mezcla de dos componentes en fase líquida. En concreto, la división inteína covalente une dos bloques de construcción en fase líquida a través de una reacción de trans-empalme, produciendo una unidad polipéptido flanqueada por unidades de reticulación que a su vez auto se ensambla en un hid...

Los hidrogeles hechos enteramente de las proteínas tienen el potencial para avanzar significativamente campos tan diversos como la ingeniería de tejidos, la administración de fármacos y biofabricación 1. Ofrecen ventajas sobre hidrogeles poliméricos sintéticos tradicionales, incluyendo la biocompatibilidad y el potencial para apoyar de forma no invasiva la incorporación de proteínas globulares bioactivos. En este trabajo se describe el desarrollo de una novela de hidrogel de proteína formada por una reacción de trans-empalme proteína dividida intein mediada y su aplicación como un andamio inmovilización de proteínas (Figura 1). Los bloques de construcción para este hidrogel son dos copolímeros de bloque de proteína que comprenden cada uno el fragmento N-o C-terminal de una fracción de intein (EN e IC) y una subunidad de una proteína multimérica reticulante. La inteína DnaE de Nostoc punctiforme (Npu) se utilizó como la división inteína 2,3 y una pequeña proteína trimérica (12 kDa) CUTA de Pyrococcus horikoshii &lt;/ Em&gt; se utilizó como 4,5 proteína reticulante. Diferentes agentes de reticulación se unen a través de reacción de trans-empalme inteína catalizada, lo que lleva a la formación de una red de proteínas altamente reticulado (hidrogel). Inteína Npu fue elegido debido a su cinética de reacción rápida (t 1/2 = 63 seg) y alto rendimiento trans-empalme (cerca del 80%) 2,3. La proteína CUTA fue elegido como el agente de reticulación debido a su alta estabilidad. Trímeros CUTA tienen una temperatura de desnaturalización de cerca de 150 ° C y conservan la estructura cuaternaria trimérica en soluciones que contienen tanto como 5 M hidrocloruro de guanidina 4,6. Desde intercambio de subunidades entre diferentes agentes de reticulación es un contribuyente importante de la erosión de la superficie de hidrogel física 7, la fuerte interacción entre la subunidad de Cuta debería desalentar este tipo de intercambios de subunidades, lo que lleva a un hidrogel más estable. Uno de estos bloques de construcción también contiene un péptido S-fragmento altamente hidrofílico como la mitad de la cuadra para facilitar aguaretención 8. La mezcla de los dos bloques de construcción de hidrogel inicia una reacción de trans-empalme entre el EN y IC inteína fragmentos, la generación de una cadena de polipéptido más largo con agentes de reticulación en ambos terminales. Los reticulantes de múltiples tales unidades moleculares interactúan entre sí, formando una red de hidrogel altamente reticulado (Figura 1A). Una &quot;estación de acoplamiento de péptidos&quot; específica (DSP) se incorpora en uno de los bloques de construcción de hidrogel para facilitar la inmovilización estable de una &quot;proteína de acoplamiento&quot; (DP)-etiquetados proteína diana en el hidrogel. El uso de una fracción de inteína para mediar el ensamblaje de hidrogel no sólo proporciona una flexibilidad adicional para la síntesis de hidrogel de proteína, sino que también permite alta densidad, una carga uniforme de la proteína diana a través de todo el hidrogel, como las proteínas diana se cargan antes de la formación de hidrogel. La proteína de hidrogel intein mediada es altamente Stables en solución acuosa con poca o ninguna erosión detectable después de 3 meses a temperatura ambiente. Estabilidad es retenido en una amplia gama de pH (6-10) y temperaturas (4-50 ° C), y el hidrogel también es compatible con disolventes orgánicos. Este hidrogel se usa para la inmovilización de dos proteínas globulares: la proteína fluorescente verde (GFP) y la peroxidasa de rábano picante (HRP). Hidrogel atrapando la última proteína se utiliza para realizar la biocatálisis en un disolvente orgánico.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:541px;" width="541">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Name 
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Company
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			Catalog Number
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Comments
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:23px;">
			Phusion High Fidelity DNA polymerase
			</td>
			<td style="width:111px;height:23px;">
			New England BioLabs
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:23px;">
			M0530S
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:23px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Competent Escherichia coli BL21 (DE3)
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			New England BioLabs
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			C2527I
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Luria Bertani
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			90003-350
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Bacto Agar Media
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			<a href="https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=90000-760">90000-760</a>
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			kanamycin sulfate
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			<a href="https://www.vwrsp.com/catalog/product/index.cgi?catalog_number=97061-602">97061-602</a>
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			IPTG
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			EM-5820
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			Imidazole
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			EM-5720
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			Urea
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			EM-9510
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			Dithiothreitol (DTT)
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			BP172-5
			</td>
			<td style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Protease Inhibitor cocktail
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Roche Applied Science
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			11836153001
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			DPBS
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			82020-066
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Brilliant Blue R
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Acros Organics
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			A0297990
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Sodium Azide
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC190380050
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Horseradish peroxidase
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			P8125-5KU
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			N,N-dimethyl-p-phenylene diamine
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC408460250
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			phenol
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC149340500
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			tert-butyl hydroperoxide
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC180340050
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			n-heptane
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Acros Organics
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			120340010
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;"></td>
			<td style="width:111px;height:21px;"></td>
			<td style="width:118px;height:21px;"></td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Shaker/Incubator
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			Max Q 6000
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Centrifuge
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Sorvall
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			RC 6
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Sonicator
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			QSonica
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			Misonix 200
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Ultrafiltration Tubes
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Amicon Ultra
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			UFC903024
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			&#160;Ni Sepharose High Performance HisTrap column
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			GE Healthcare Life Sciences
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			17-5248-01
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			GE Healthcare Life Sciences
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			17-5156-01
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Plate reader
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Molecular Devices
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			SpectraMax Gemini EM
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of an intein-mediated artificial protein hydrogel

Se presenta la síntesis de un hidrogel altamente estable de proteínas mediada por una reacción de trans-empalme proteína dividida inteína catalizada. Los bloques de construcción de este hidrogel son dos copolímeros de bloque de proteína conteniendo cada uno una subunidad de una proteína trimérica que sirve como un agente de reticulación y una media de un intein dividida. Una bobina al azar altamente hidrófilo se inserta en uno de los copolímeros de bloque para la retención de agua. La mezcla de los dos copolímeros de bloques de proteína desencadena una reacción de trans-empalme inteína, produciendo una unidad de polipéptido con agentes de reticulación en cada extremo que rápidamente se auto-ensambla en un hidrogel. Este hidrogel es muy estable bajo condiciones ácidas y básicas, a temperaturas de hasta 50 ° C, y en disolventes orgánicos. El hidrogel rápidamente las reformas después de la ruptura inducida por cizalla. La incorporación de una &quot;estación de acoplamiento peptídico&quot; en el bloque de construcción de hidrogel permite la incorporación conveniente de &quot;proteína de acoplamiento&quot;-etiquetados proteínas diana.El hidrogel es compatible con el medio de crecimiento de cultivo de tejidos, apoya la difusión de moléculas de 20 kDa, y permite la inmovilización de proteínas globulares bioactivos. La aplicación del hidrogel de proteína mediada por inteína-como un biocatalizador compatible con disolventes orgánicos se demostró mediante la encapsulación de la enzima peroxidasa de rábano picante y corroborar su actividad.

Un esquema para la formación de hidrogel de proteína intein mediada se presenta en la Figura 1A. Los bloques de construcción de hidrogel son la proteína copolímeros Cuta-NpuN (N) y NPUC-S-cuta (C) (Figura 1A, Tabla 1). NpuN / C son las N-/C-fragments del DnaE dividir naturalmente inteína de Nostoc punctiforme (Npu). Cuta es una proteína trimérica estable de Pyrococcus horikoshii 4,5. La mezcla de purificado N y C en la presencia del agente reductor TDT induce...

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Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Se presenta la síntesis de un hidrogel de proteína dividida intein mediada. Los bloques de construcción de este hidrogel son dos copolímeros de proteína conteniendo cada uno una subunidad de una proteína trimérica que sirve como un agente de reticulación y una media de un intein dividida. La mezcla de los dos copolímeros de proteínas desencadena una reacción de trans-empalme inteína, produciendo una unidad de polipéptido que se auto-ensambla en un hidrogel. Este hidrogel es altamente pH y temperatura estable, compatible con disolventes orgánicos, y fácilmente incorpora proteínas globulares funcionales.

Síntesis de una proteína artificial mediada Intein hidrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

synthesis-of-an-intein-mediated-artificial-protein-hydrogel

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.0K vistas.  Texas A&M University, College Station.  Se presenta la síntesis de un hidrogel de proteína dividida intein mediada. Los bloques de construcción de este hidrogel son dos copolímeros de proteína conteniendo cada uno una subunidad de una proteína trimérica que sirve como un agente de reticulación y una media de un intein dividida. La mezcla de los dos copolímeros de proteínas desencadena una reacción de trans-empalme inteína, produciendo una unidad de polipéptido que se auto-ensambla en un h...

Video: Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

Síntesis, de la Asamblea, y caracterización de una sola capa de nanopartículas de oro protegidas Films de Electroquímica de proteínas monocapa

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Investigación

Bioingeniería

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

Síntesis combinatoria y de alto rendimiento liberación de proteínas de película de polímero y nanopartículas Bibliotecas

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the limited access to donor hearts. An example of a treatment to recover the function of the heart consists of the local delivery of drugs and bioactives from a hydrogel. In this paper a method is introduced to formulate and inject a drug-loaded hydrogel non-invasively and side-specific into the pig heart using a long, flexible catheter. The use of 3-D electromechanical mapping and injection via a catheter allows side-specific treatment of the myocardium. To provide a hydrogel compatible with this catheter, a supramolecular hydrogel is used because of the convenient switching from a gel to a solution state using environmental triggers. At basic pH this ureido-pyrimidinone modified poly(ethylene glycol) acts as a Newtonian fluid which can be easily injected, but at physiological pH the solution rapidly switches into a gel. These mild switching conditions allow for the incorporation of bioactive drugs and bioactive species, such as growth factors and exosomes as we present here in both in vitro and in vivo experiments. The in vitro experiments give an on forehand indication of the gel stability and drug release, which allows for tuning of the gel and release properties before the subsequent application in vivo. This combination allows for the optimal tuning of the gel to the used bioactive compounds and species, and the injection system.

Supramolecular hydrogelators based on ureido-pyrimidinones allow full control over the macroscopic gel properties and the sol&#8211;gel switching behavior using pH. Here, we present a protocol for formulating and injecting such a supramolecular hydrogelator via a catheter delivery system for local delivery directly in relevant areas in the pig heart.

Un supramolecular hidrogel inyectable de Drogas y cargadas para Inyección local catéter en el corazón de cerdo

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel capabilities to perform basic and applied sciences in test tube reactions. Over the past decade, cell-free TXTL has become a powerful technique for a broad range of novel multidisciplinary research areas related to quantitative and synthetic biology. The new TXTL platforms are particularly useful to construct and interrogate biochemical systems through the execution of synthetic or natural gene circuits. In vitro TXTL has proven convenient to rapidly prototype regulatory elements and biological networks as well as to recapitulate molecular self-assembly mechanisms found in living systems. In this article, we describe how infectious bacteriophages, such as MS2 (RNA), &#934;&#935;174 (ssDNA), and T7 (dsDNA), are entirely synthesized from their genome in one-pot reactions using an all Escherichia coli, cell-free TXTL system. Synthesis of the three coliphages is quantified using the plaque assay. We show how the yield of synthesized phage depends on the biochemical settings of the reactions. Molecular crowding, emulated through a controlled concentration of PEG 8000, affects the amount of synthesized phages by orders of magnitudes. We also describe how to amplify the phages and how to purify their genomes. The set of protocols and results presented in this work should be of interest to multidisciplinary researchers involved in cell-free synthetic biology and bioengineering.

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation platforms has been engineered to construct biochemical systems in vitro through the execution of gene circuits. In this article, we describe how bacteriophages, such as MS2, &#934;&#935;174, and T7, are synthesized from their genome using an all E. coli cell-free TXTL system.

Síntesis de bacteriófagos infecciosas en una e. coli -basan sistema de expresión libre

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

An Additive Manufacturing Technique for the Facile and Rapid Fabrication of Hydrogel-based Micromachines with Magnetically Responsive Components

Polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels are biocompatible hydrogels that have been approved for use in humans by the FDA. Typical PEG-based hydrogels have simple monolithic architectures and often function as scaffolding materials for tissue engineering applications. More sophisticated structures typically take a long time to fabricate and do not contain moving components. This protocol describes a photolithography method that allows for facile and rapid microfabrication of PEG structures and devices. This strategy involves an in-house developed fabrication stage that allows for the rapid fabrication of 3D structures by building upwards in a layer-by-layer fashion. Independent moving components can also be aligned and assembled onto support structures to form integrated devices. These independent components are doped with superparamagnetic iron oxide nanoparticles that are sensitive to magnetic actuation. In this manner, the fabricated devices can be actuated using external magnets to yield movement of the components within. Hence, this technique allows for the fabrication of sophisticated MEMS-like devices (micromachines) that are composed entirely out of a biocompatible hydrogel, able to function without an onboard power source, and respond to a contact-less method of actuation. This manuscript describes the fabrication of both the fabrication set-up as well as the step-by-step method for the microfabrication of these hydrogels-based MEMS-like devices.

An additive manufacturing strategy for processing UV-crosslinkable hydrogels has been developed. This strategy allows for the layer-by-layer assembly of microfabricated hydrogel structures as well as the assembly of independent components, yielding integrated devices containing moving components that are responsive to magnetic actuation.

Un aditivo fabricación técnica para la fabricación fácil y rápida de Micromachines base de hidrogel con componentes magnéticamente sensibles

Polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels are biocompatible hydrogels that have been approved for use in humans by the FDA. Typical PEG-based hydrogels ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Fabricación de una Matriz microambiente celular Artificial multiplexados

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with controlled pore structure and mechanical properties. Cellulose nanocrystals (CNCs, 69.62 wt%) based hydrogel ink with matrix (sodium alginate and gelatin) was developed and 3D printed into scaffolds with uniform and gradient pore structure (110-1,100 &#181;m). The scaffolds showed compression modulus in the range of 0.20-0.45 MPa when tested in simulated in vivo conditions (in distilled water at 37 &#176;C). The pore sizes and the compression modulus of the 3D scaffolds matched with the requirements needed for cartilage regeneration applications. This work demonstrates that the consistency of the ink can be controlled by the concentration of the precursors and porosity can be controlled by the 3D printing process and both of these factors in return defines the mechanical properties of the 3D printed porous hydrogel scaffold. This process method can therefore be used to fabricate structurally and compositionally customized scaffolds according to the specific needs of patients.&#160;

The three critical steps of this protocol are i) developing the right composition and consistency of the cellulose hydrogel ink, ii) 3D printing of scaffolds into various pore structures with good shape fidelity and dimensions and iii) demonstration of the mechanical properties in simulated body conditions for cartilage regeneration.

3D impreso celulosa poroso nanocompuesto hidrogel andamios

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an attractive alternative to liposomes or fatty acid-based vesicles. Externally or within the vesicles, peptides can be easily expressed and simplify the synthesis of membrane precursors. Provided here is a protocol for the creation of vesicles with diameters of ~200 nm based on the amphiphilic elastin-like polypeptides (ELP) utilizing dehydration-rehydration from glass beads. Also presented are protocols for bacterial ELP expression and purification via inverse temperature cycling, as well as their covalent functionalization with fluorescent dyes. Furthermore, this report describes a protocol to enable the transcription of RNA aptamer dBroccoli inside ELP vesicles as a less complex example for a biochemical reaction. Finally, a protocol is provided, which allows in vesiculo expression of fluorescent proteins and the membrane peptide, whereas synthesis of the latter results in vesicle growth.

Presented here are protocols for the creation of peptide-based small unilamellar vesicles capable of growth. To facilitate in vesiculo production of the membrane peptide, these vesicles are equipped with a transcription-translation system and the peptide-encoding plasmid.

En Vesiculo Síntesis de Precursores de Membrana De péptido para crecimiento de la vesícula Autónoma

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These issues represent drawbacks in workflows that can ultimately result in irreproducibility of research findings. Manual-based workflows are further limiting the advancement and widespread adoption of viscous materials, such as hydrogels used for biomedical applications. These challenges can be overcome by using automated workflows with standardized mixing processes to increase reproducibility. In this study, we present step-by-step instructions to use an open source protocol designer, to operate an open source workstation, and to identify reproducible mixtures. Specifically, the open source protocol designer guides the user through the experimental parameter selection and generates a ready-to-use protocol code to operate the workstation. This workstation is optimized for pipetting of viscous materials to enable automated and highly reliable handling by the integration of temperature docks for thermoresponsive materials, positive displacement pipettes for viscous materials, and an optional tip touch dock to remove excess material from the pipette tip. The validation and verification of mixtures are performed by a fast and inexpensive absorbance measurement of Orange G. This protocol presents results to obtain 80% (v/v) glycerol mixtures, a dilution series for gelatin methacryloyl (GelMA), and double network hydrogels of 5% (w/v) GelMA and 2% (w/v) alginate. A troubleshooting guide is included to support users with protocol adoption. The described workflow can be broadly applied to a number of viscous materials to generate user-defined concentrations in an automated fashion.

This protocol serves as a comprehensive tutorial for standardized and reproducible mixing of viscous materials with a novel open source automation technology. Detailed instructions are provided on the operation of a newly developed open source workstation, the usage of an open source protocol designer, and the validation and verification to identify reproducible mixtures.

Una plataforma tecnológica de código abierto para fabricar modelos de cultivo 3D basados en hidrogel de manera automatizada y estandarizada

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous developments have made the CFPS platform more accessible to new users and have expanded the range of applications. For lysate based CFPS systems, cell extracts can be generated from a variety of organisms, harnessing the unique biochemistry of that host to augment protein synthesis. Within the last 20 years, Escherichia coli (E. coli) has become one of the most widely used organisms for supporting CFPS due to its affordability and versatility. Despite numerous key advances, the workflow for E. coli cell extract preparation has remained a key bottleneck for new users to implement CFPS for their applications. The extract preparation workflow is time-intensive and requires technical expertise to achieve reproducible results. To overcome these barriers, we previously reported the development of a 24 hour cell-free autoinduction (CFAI) workflow that reduces user input and technical expertise required. The CFAI workflow minimizes the labor and technical skill required to generate cell extracts while also increasing the total quantities of cell extracts obtained. Here we describe that workflow in a step-by-step manner to improve access and support the broad implementation of E. coli based CFPS.

This work describes the preparation of cell extract from Escherichia coli (E. coli) followed by cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in under 24 hours. Explanation of the cell-free autoinduction (CFAI) protocol details improvements made to reduce researcher oversight and increase quantities of cell extract obtained.