La absorción de glucosa es la clave para comprender la salud y la enfermedad. Como la glucosa juega un papel fundamental en las demandas metabólicas y estructurales en el cuerpo humano, además de desempeñar un papel vital en la regulación. La medición extracelular de la glucosa permite el desarrollo de ensayos de alto rendimiento para la cinética de la absorción de glucosa en células, tejidos y órganos de diferentes antecedentes genéticos en respuesta a nutrientes o fármacos.
Este ensayo sería una herramienta valiosa para el descubrimiento de terapias y nutrición para la diabetes, el cáncer, las enfermedades degenerativas del sistema nervioso central, la obesidad y todas las enfermedades de la glucosa y el metabolismo. El ensayo necesita un ajuste de tiempo para la inanición y la estimulación que debe basarse en especificaciones metabólicas para diferentes tejidos y cultivos celulares. Cultivo de fibroblastos de ratón 3T3-L1 mediante recubrimiento de 10 a las 6 células, diluido en 20 mililitros de medio 1 en placas de 296 pocillos.
Placa de 100 microlitros de suspensión celular por pozo, asegurando mantener la homogeneidad de esta suspensión mediante la mezcla. Cultive células durante 48 horas en una incubadora de 37 grados centígrados sin cambiar de medio hasta aproximadamente 70 a 80% de confluencia. Mantener las células confluentes y en ayunas cultivándolas en el mismo medio durante 48 horas.
Varíe el tiempo de incubación de 24 a 72 horas, dependiendo del estado catabólico de ayuno deseado. Decantar los medios de las células en las placas de 96 pocillos. Absorba el líquido restante con toallas de papel estériles.
Enjuague la placa de 96 pocillos con 100 microlitros de PBS por pocillo y absorba el líquido restante con toallas de papel estériles. Agregue 100 microlitros de DMEM libre de glucosa por pocillo e incube durante 40 minutos. Ajuste el tiempo de incubación dependiendo de los estímulos del tipo celular y el nivel deseado de ayuno.
Utilice ocho réplicas para cada condición de simulación. Por lo tanto, prepare un mililitro para cada condición de simulación. Utilice siete condiciones de simulación sin insulina.
Glucosa FD de 2.5 microgramos por mililitro, 1 microgramo por mililitro, 0.5 microgramos por mililitro, 0.2 microgramos por mililitro, 0.1 microgramos por mililitro, 0.05 microgramos por mililitro y 0 miligramos por mililitro en placa de 196 pocillos. Use siete condiciones de estimulación con insulina. FD glucosa de 2.5 microgramos por mililitro, 1 microgramo por mililitro, 0.5 microgramos por mililitro, 0.2 microgramos por mililitro, 0.1 microgramos por mililitro, 0.05 microgramos por mililitro y 0 microgramos por mililitro en otra placa de 96 pocillos.
Para preparar las condiciones de estimulación, diluya un microlitro de cinco miligramos por mililitro de solución de trabajo de glucosa FD y 999 microlitros de DMEM libre de glucosa para obtener un mililitro de solución de material de trabajo. Usando esta solución de material de trabajo, prepare de 1 a 2000, 1 a 5, 000, 1 a 10, 000, 1 a 25, 000, 1 a 50, 000 y 1 a 100, 000 delirios de glucosa FD para obtener 2.5 microgramos por mililitro, 1 microgramo por mililitro, 0.5 microgramos por mililitro, 0.2 microgramos por mililitro, 0.1 microgramos por mililitro, 0,05 microgramos por mililitro en tubos de dos mililitros inmediatamente antes de los experimentos en un gabinete de bioseguridad sin luces. Agregue un microlitro de insulina a cada una de estas condiciones.
Después de 40 minutos de incubación, decantar el DMEM libre de glucosa de cada pocillo en placas de 96 pocillos y absorber el líquido restante con toallas de papel estériles. Agregue 100 microlitros cada uno de las diversas condiciones de tratamiento descritas anteriormente, a los pozos a lo largo de una columna. Y 100 microlitros de la misma condición de tratamiento a los pozos a lo largo de la fila en ambas placas de pared 96.
Etiquete las placas que utilizaron las condiciones, con y sin insulina. Agregue DMEM libre de glucosa solo a los pocillos de control. Incubar la placa durante 40 minutos en la incubadora de cultivo celular en la oscuridad.
Después de que las células hayan sido estimuladas durante 40 minutos. Transfiera los medios de estimulación de ambas placas a nuevas placas de 96 pocillos, manteniendo el mismo diseño experimental. Lave las celdas con PBS.
Retire PBS y decantar cualquier solución restante en toallas de papel estériles. Agregue un inhibidor de la proteasa al tampón del ensayo de inmunoprecipitación de radio para proteger las proteínas. Coloque las placas que contienen el ensayo de inmunoprecipitación de radio en un agitador durante 30 minutos.
Usando un lector de microplacas, mida la fluorescencia en longitudes de onda de excitación y emisión a 485 y 535 nanómetros respectivamente. Primero en el medio que contiene glucosa FD extracelular, y luego en la placa con células lizadas de ensayo de radioinmunoprecipitación al final de 30 minutos de incubación. Realice el ensayo de proteína BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Cuantificar las concentraciones de proteínas en cada pocillo que contiene células de ensayo de radioinmunoprecipitación. Use 10 microlitros del homogeneizado del ensayo de inmunoprecipitación de radio, y mida las concentraciones de proteínas, y triplique para aumentar la precisión de las mediciones en placas de 96 pocillos. Cuantificar la proteína basada en estándares de proteínas analizados junto con muestras en cada placa de 96 pocillos.
Incubar los tejidos u órganos cosechados en una placa de seis pocillos que contenga PBS durante un minuto. Maneje cada tejido u órgano en un pocillo separado. Después de un minuto, coloque cada pañuelo de papel en una toalla de papel estéril para absorber PBS.
Transfiera tejidos u órganos en una placa separada de seis paredes que contenga 4, 000 microlitros de DMEM libre de glucosa e incube durante dos minutos. Después de dos minutos, retire y transfiera los tejidos a los pocillos de una placa de seis pocillos que contenga 0,29 milimolar de solución de trabajo de glucosa FD. Incubar las seis placas de pocillos que contienen tejidos en solución de trabajo de glucosa FD a 37 grados centígrados.
Recolectar 100 microlitros de solución de trabajo de glucosa FD de cada pocillo después de 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 y 120 minutos de incubación, y transferir 100 microlitros recolectados de solución de trabajo de glucosa FD en placas de 96 pocillos para analizar la cinética del agotamiento extracelular de glucosa FD. Agitar antes y después de la recolección. Mida la fluorescencia en excitación en longitudes de onda de emisión a 485 y 535 nanómetros respectivamente utilizando un lector de microplacas.
La dependencia de la dosis en la captación intracelular de glucosa FD aumentó significativamente en presencia de insulina. La estimulación con insulina condujo a una disminución significativa de los niveles de glucosa FD extracelular en comparación con las muestras sin estimulación con insulina. El agotamiento extracelular de la glucosa FD puede medir un cambio en la captación de glucosa con una precisión comparable a la captación intracelular de glucosa FD.
La FD glucosa extracelular no se agotó en la grasa visceral de control no estimulada durante 120 minutos de incubación. En contraste, el pretratamiento de ratones con insulina o AAC2 antes de la disección, condujo a un agotamiento significativo de la glucosa FD extracelular dentro de un intervalo de tiempo de 30 minutos y 60 minutos, respectivamente. La glucosa FD extracelular no se agotó en los explantes hepáticos estimulados con insulina, en comparación con los explantes hepáticos no estimulados.
La glucosa FD extracelular disminuyó significativamente de la manera dependiente del tiempo, y se observaron explantes hepáticos pretratados con AAC2.22% de agotamiento de glucosa en el medio extracelular que contenía el cerebro no tratado después de 60 minutos de incubación. El medio incubado con cerebros de ratones tratados con insulina ha mostrado una disminución lineal del 5% en la glucosa FD. Los cerebros estimulados por AAC2 condujeron a una profunda disminución rápida al 67,4% de la glucosa FD extracelular durante los primeros 20 minutos.
Las sustancias que implican lavado son especialmente importantes para eliminar restos de glucosa, sangre o suero dentro del medio y/o órganos, ya que pueden interferir con la lectura de fluorescencia de estos medios. Después de un alto rendimiento, la identificación de compuestos de metabolitos en genes con propiedades glucémicas, así como las condiciones óptimas para su acción en experimentos in vivo, se pudo validar con glucosa FD marcada y escaneo PET para confirmar la acumulación de glucosa en órganos específicos. Esta técnica para el descubrimiento de la acción glucémica es beneficiosa en la eliminación de numerosos metabolitos, terapias o sus combinaciones, y destaca sus acciones en diferentes órganos.
