Esta investigación fue financiada por la Oficina de Ciencia y Tecnología de la ciudad de Xiamen (3502Z20227197) y la Oficina de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Fujian (No. 2019J01070, No.2021Y0027).

1. Preparación
<ol><li>Tratamiento de la muestra<ol><li>Diseccionar cuidadosamente S. nudus fresco (100 g) y recoger el intestino y su líquido interno.</li>
		<li>Añadir 300 ml de tampón Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4) para homogeneización (1.000 rpm, 60 s).</li>
		<li>Congelar-descongelar el homogeneizado 3x.</li>
		<li>Centrifugar la muestra (10.956 × g, 0,5 h, 4 °C) y recoger el sobrenadante. Conservar la muestra a 4 °C hasta su uso posterior.</li>
	</ol></li>
	<li>Precipitación de proteínas<ol><li>Mezclar el sobrenadante con una solución saturada de sulfato de amonio (nueve volúmenes) y dejar reposar la mezcla durante 12 h a 4 °C. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí y continuar más tarde.</li>
		<li>Centrífuga (10.956 × g, 0,5 h, 4 °C) para obtener el precipitado proteico; Almacénelo a 4 °C para su uso posterior.</li>
	</ol></li>
	<li>Resuspensión proteica<ol><li>Resuspender el precipitado proteico con 30 mL de tampón Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4). Conservar esta solución de proteína cruda a 4 °C para su uso posterior.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cromatografía de afinidad
<ol><li>Filtración de soluciones<ol><li>Filtrar la solución de proteína cruda a través de una membrana filtrante de 0,22 μm. Conservar esta muestra a 4 °C para su uso posterior.</li>
	</ol></li>
	<li>Embalaje de columnas<ol><li>Empaque la columna de cromatografía de afinidad de matriz de arginina-agarosa y la columna de cromatografía de afinidad de matriz de lisina-agarosa cargando una cantidad adecuada de medio de matriz de lisina-agarosa y medio de matriz de arginina-agarosa en columnas de cromatografía vacías de 5 ml. NOTA: La columna se puede almacenar a 2-8 °C, con la matriz sumergida en tampón de almacenamiento (20% de etanol).</li>
	</ol></li>
	<li>Purificación de afinidad<ol><li>Equilibrar la columna de cromatografía de afinidad con ddH2O primero (1 mL/min, 10 volúmenes de columna), seguido de tampón Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, 1 mL/min, 5 volúmenes de columna).</li>
		<li>Cargue la muestra de solución de proteína en la columna preequilibrada (1 ml/min, volumen de 1/3 columna). NOTA: El volumen de carga de la muestra depende de la concentración de sFE.</li>
		<li>Lave la columna con tampón Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, volúmenes de cinco columnas).</li>
		<li>Eluya la columna con 0,15 M, 0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M y 0,65 M NaCl (1 ml/min, cinco volúmenes de columna) sucesivamente.</li>
		<li>Busque el pico de elución que debe aparecer en la elución de NaCl 0.15 M y luego recoja las fracciones en tubos de 5 ml.</li>
		<li>Concentrar la muestra de elución utilizando un filtro ultracentrífugo de 3 kD (3.944 × g, 1,5 h, 4 °C). Conservar esta muestra a -80 °C para su uso posterior.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Evaluación de la pureza
<ol><li>Preparación en gel de electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil-sulfato de sodio (SDS-PAGE)<ol><li>Preparar el gel SDS-PAGE según el método de Laemmli utilizando gel concentrado al 5% y gel de separación al 12%13.</li>
	</ol></li>
	<li>Electroforesis<ol><li>Mezclar la muestra (15 μL) con 5 tampón de carga de proteínas SDS-PAGE (1/4 volumen), calentar en agua hirviendo durante 5 min, cargar en el gel SDS-PAGE y hacer correr el gel a 80 V, 60 mA durante 1,5 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis<ol><li>Después de la electroforesis, tiñe el gel con un kit de tinción de plata, de acuerdo con el protocolo del fabricante, y observe el gel teñido utilizando un sistema de imágenes quimioluminiscentes.</li>
		<li>Analice la pureza de la proteína diana utilizando la siguiente fórmula: pureza de la proteína diana = valor de intensidad de la proteína diana/valor de intensidad de la proteína total.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Evaluación de la actividad fibrinolítica
<ol><li>Preparación de la placa de fibrina<ol><li>Preparar la solución de fibrinógeno mezclando 25 mg de fibrinógeno con 1,25 ml de solución salina fisiológica.</li>
		<li>Prepare la solución de trombina mezclando completamente 100 U de trombina con 1,05 ml de solución salina fisiológica.</li>
		<li>Preparar la solución de agarosa añadiendo 0,5 g de agarosa a 22,5 ml de tampón Tris-HCl (0,02 mol/L, pH 7,4). Mezclar y calentar la solución de agarosa a 100 °C hasta que se disuelva completamente.</li>
		<li>Enfriar la solución de agarosa hasta unos 50 °C y añadir la solución de fibrinógeno. Luego, agregue inmediatamente la solución de trombina, mézclelos rápidamente y viértalos en una fuente de cultivo de 60 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Carga<ol><li>Perforar pocillos de 3 mm en las placas de fibrina preparadas utilizando un barrenador estéril y llenar los pocillos con muestras de 10 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis<ol><li>Después de 18 h de incubación a 37 °C, medir la actividad fibrinolítica calculando el tamaño de sus zonas degradantes. Actividad fibrinolítica = (tamaño de zona de la muestra/tamaño de zona de la uroquinasa) x 100 U. Tamaño de zona = diámetro x diámetro. NOTA: Para el control blanco, el control negativo y el control positivo se utilizaron tampón salino fisiológico, proteína cruda (muestra obtenida en el paso 1.3.1 del protocolo) y uroquinasa. En comparación con la uroquinasa, encontramos que la actividad fibrinolítica de la sFE purificada fue ~ 19,200 U / ml.</li>
	</ol></li>
</ol>

Purificación de una enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus mediante cromatografía de afinidad

<ol>
	<li>Rosell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patients+with+COVID-19+have+elevated+levels+of+circulating+extracellular+vesicle+tissue+factor+activity+that+is+associated+with+severity+and+mortality-brief+report.">Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).</li><li>Schultz, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombosis+and+thrombocytopenia+after+ChAdOx1+nCoV-19+vaccination.+The+New+England.">Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England.</a> Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).</li><li>von Kaulla, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urokinase-induced+fibrinolysis+of+human+standard+clots.">Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots.</a> Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).</li><li>Van de Werf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+thrombolysis+with+tissue-type+plasminogen+activator+in+patients+with+evolving+myocardial+infarction.">Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction.</a> The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).</li><li>Schaller, J., Gerber, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasmin-antiplasmin+system:+structural+and+functional+aspects.">The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).</li><li>Ge, Y. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+antithrombotic+protease+from+marine+worm+Sipunculus+nudus.">A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+novel+fibrinolytic+enzyme+from+culture+supernatant+of+Pleurotus+ostreatus.">Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).</li><li>Choi, J. -. H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starase:+A+bi-functional+fibrinolytic+protease+from+hepatic+caeca+of+Asterina+pectinifera+displays+antithrombotic+potential.">Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential.</a> Biochimie. 105, 45-57 (2014).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fibrinolytic+protein+From+Pheretima+vulgaris:+purification,+identification,+antithrombotic+evaluation,+and+mechanisms+investigation.">A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419 (2022).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant,+hypolipidemic+and+hepatic+protective+activities+of+polysaccharides+from+Phascolosoma+esculenta.">Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta.</a> Marine Drugs. 18 (3), 158 (2020).</li><li>. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm Available from: <a target="_blank" href="https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en">https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en</a> (2019)</li><li>Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+expressed+differentially+in+female+and+male+gametes+of+Sipunculus+nudus.">Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus.</a> Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).</li><li>Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+renature+DNA-binding+proteins+separated+by+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis.">A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).</li><li>Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+barcoding+reveals+cryptic+diversity+in+the+peanut+worm+Sipunculus+nudus.">DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus.</a> Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).</li><li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen-plasmin+system.+I.+Purification+and+properties+of+human+plasminogen.">Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).</li><li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen-plasmin+system.+II.+Purification+and+properties+of+human+plasmin.">Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).</li><li>Wiman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-chromatographic+purification+of+human+&#945;2-antiplasmin.">Affinity-chromatographic purification of human &#945;2-antiplasmin.</a> The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).</li><li>Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+purification+and+characterization+of+a+new+fast-acting+plasmin+inhibitor+from+human+platelets.+Evidence+for+non-identity+with+the+known+plasma+proteinase+inhibitors.">Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors.</a> The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).</li><li>Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+human+plasma/cellular+fibronectin+and+fibronectin+fragments.">Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments.</a> Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).</li><li>Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+and+purification+of+human+recombinant+tissue+type+plasminogen+activator+(rt-PA)+from+transgenic+tobacco+plants.">Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants.</a> Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).</li><li>Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+abnormalities+of+human+plasminogen+isolated+from+synovial+fluid+of+rheumatoid+arthritis+patients.">Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients.</a> Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).</li></ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Debido a la falta de disponibilidad de la secuencia génica exacta de sFE, la sFE utilizada actualmente se extrajo de S. nudus14 fresco. Además, los procedimientos de purificación de sFE descritos en la literatura fueron complicados y costosos, ya que se basaron en algunas características generales de sFE, como el peso molecular, el punto isoeléctrico, la fuerza iónica y la polaridad15,16. Hasta la fecha no se ha informado de...

La trombosis es una amenaza importante para la salud pública, especialmente después de la pandemia mundial de Covid-19 1,2. Clínicamente, muchos activadores del plasminógeno (AP), como el activador del plasminógeno de tipo tisular (tPA) y la uroquinasa (Reino Unido), se han utilizado ampliamente como fármacos trombolíticos. Los PA pueden activar el plasminógeno de los pacientes en plasmina activa para degradar la fibrina. Así, su eficiencia trombolítica está fuertemente restringida por el estado plasminógeno de los pacientes 3,4. Los agentes fibrinolíticos, como la metaloproteinasa plasmina y la serina plasmina, son otro tipo de fármaco trombolítico clínico que también incluye enzimas fibrinolíticas (FE) como la plasmina, que pueden disolver los coágulos directamente, pero son rápidamente inactivados por varios inhibidores de la plasmina5. Posteriormente, se ha informado de un nuevo tipo de agente fibrinolítico que puede disolver el trombo no solo activando el plasminógeno en plasmina, sino también degradando la fibrina directamente 6-la enzima fibrinolítica del antiguo gusano del maní Sipunculus nudus (sFE)6. Esta bifunción otorga a sFE otras ventajas sobre los fármacos trombolíticos tradicionales, especialmente en términos de estado anormal del plasminógeno. En comparación con otros agentes fibrinolíticos bifuncionales 7,8,9, la sFE muestra varias ventajas, incluida la seguridad, sobre los agentes no derivados de alimentos para el desarrollo de fármacos, especialmente para medicamentos orales. Esto se debe a que la bioseguridad y biocompatibilidad de Sipunculus nudus han sido bien establecidas10.
Al igual que los otros agentes fibrinolíticos naturales aislados de microorganismos, lombrices de tierra y hongos, la purificación de sFE de S. nudus es muy complicada e incluye múltiples etapas, como homogeneización tisular, precipitación de sulfato de amonio, desalinización, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de interacción hidrofóbica y tamizado molecular10,11,12. Tal sistema de purificación no solo depende de habilidades competentes y materiales costosos, sino que también requiere varios días para completar todo el procedimiento. Por lo tanto, un programa simple de purificación de sFE es de gran importancia para el desarrollo posterior de sFE. Afortunadamente, dos cristales de sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) se han obtenido con éxito (ver Archivo Suplementario 1 y Archivo Suplementario 2). A través del análisis estructural y los experimentos de acoplamiento molecular, encontramos que el núcleo catalítico de sFE podría unirse específicamente a objetivos que contienen residuos de arginina o lisina.
Aquí, se propuso por primera vez un sistema de purificación de afinidad, basado en la estructura cristalina de sFE. Siguiendo este protocolo, la sFE altamente pura y altamente activa podría purificarse a partir de los extractos crudos en una sola etapa de purificación de afinidad. El protocolo desarrollado aquí no solo es importante para la preparación a gran escala de sFE, sino que también se puede aplicar para la purificación de otros agentes fibrinolíticos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose G-10</td>
			<td>Biowest</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine-Sepharose 4B</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Arginine-agarose matrix</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromoxylenol Blue (BPB)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Silver Stain Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinase</td>
			<td>RHAWN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine-Sepharose 4B</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Lysine-agarose matrix</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Color Protein Marker (10-170 kD)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT Aprotein Purification System pure</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750</td>
			<td>SANYO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence Imaging System</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Flow Pump BT-100</td>
			<td>QITE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Temperature Incubator</td>
			<td>JINGHONG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD</td>
			<td>SENXIN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric Glass Homogenizer DY89-II</td>
			<td>SCIENTZ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Analytical Balance</td>
			<td>DENVER</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12</td>
			<td>SENXIN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal Decolorization Shaker</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Machine AF 103</td>
			<td>Scotsman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KQ-500E Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>ShuMei</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer</td>
			<td>Zhi wei</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W</td>
			<td>Cence</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave Oven</td>
			<td>Galanz</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Reference</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Desktop pH Meter</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small-sized Vortex Oscillator</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Electrophoresis System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumable Material&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L PCR Tube (200 &#181;L)</td>
			<td>Axygene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube (1.5 mL)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube (5 mL)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube (50 mL)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube (7 mL)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Dish (60 mm)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Membrane (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millex GP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tip (1 mL )</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tip (10 &#181;L)</td>
			<td>Axygene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tip (200 &#181;L)</td>
			<td>Axygene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special Indicator Paper</td>
			<td>TZAKZY</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal pH Indicator</td>
			<td>SSS Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

affinity purification of a fibrinolytic enzyme from sipunculus nudus

La enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus (sFE) es un nuevo agente fibrinolítico que puede activar el plasminógeno en plasmina y degradar la fibrina directamente, mostrando grandes ventajas sobre los agentes trombolíticos tradicionales. Sin embargo, debido a la falta de información estructural, todos los programas de purificación para sFE se basan en purificaciones por cromatografía de varios pasos, que son demasiado complicadas y costosas. Aquí, se desarrolla por primera vez un protocolo de purificación de afinidad de sFE basado en una estructura cristalina de sFE; incluye la preparación de la muestra cruda y la columna de cromatografía de afinidad de la matriz lisina/arginina-agarosa, la purificación de afinidad y la caracterización del sFE purificado. Siguiendo este protocolo, un lote de sFE se puede purificar en 1 día. Además, la pureza y la actividad del sFE purificado aumentan a 92% y 19,200 U/mL, respectivamente. Por lo tanto, este es un enfoque simple, económico y eficiente para la purificación de sFE. El desarrollo de este protocolo es de gran importancia para la utilización posterior de sFE y otros agentes similares.

Thrombosis is a major threat to public health, especially following the Covid-19 global pandemic1,2. Clinically, many plasminogen activators (PAs), such as tissue-type plasminogen activator (tPA) and urokinase (UK), have been widely used as thrombolytic drugs. PAs can activate patients&#39; plasminogen into active plasmin to degrade fibrin. Thus, their thrombolytic efficiency is heavily restricted by the patients&#39; plasminogen status3,4. Fibrinolytic agents, such as metalloproteinase plasmin and serine plasmin, are another type of clinical thrombolytic drug that also include fibrinolytic enzymes (FE) such as plasmin, which can dissolve clots directly but are quickly inactivated by various plasmin inhibitors5. Subsequently, a novel type of fibrinolytic agent has been reported that can dissolve the thrombus by not only activating the plasminogen into plasmin but also degrading the fibrin directly6-the fibrinolytic enzyme from the ancient peanut worm Sipunculus nudus (sFE)6. This bifunction endows sFE other advantages over traditional thrombolytic drugs, especially in terms of abnormal plasminogen status. Compared with other bifunctional fibrinolytic agents7,8,9, sFE displays several advantages, including safety, over non-food derived agents for drug development, especially for oral drugs. This is because the biosafety and biocompatibility of Sipunculus nudus have been well-established10.
Similar to the other natural fibrinolytic agents isolated from microorganisms, earthworms, and mushrooms, the purification of sFE from S. nudus is very complicated and includes multiple stages, such as tissue homogenization, ammonium sulphate precipitation, desalination, anion-exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, and molecular sieving10,11,12. Such a purification system not only depends on proficient skills and expensive materials, but also requires several days to complete the whole procedure. Therefore, a simple purification program of sFE is of great significance for the further development of sFE. Fortunately, two crystals of sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) have been successfully obtained (see Supplemental File 1 and Supplemental File 2). Through structural analysis and molecular docking experiments, we found that the catalytic core of sFE could specifically bind to targets containing arginine or lysine residues.
Herein, an affinity purification system was proposed for the first time, based on the crystal structure of sFE. By following this protocol, highly pure and highly active sFE could be purified from the crude extracts in a single affinity purification stage. The protocol developed here is not only important for the large scale preparation of sFE, but also may be applied for the purification of other fibrinolytic agents.

Autor destacado: Purificación por afinidad de una enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus  

Purificación por afinidad de una enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus

Our research is mainly about the purification of fibrinolytic enzyme. This work tries to establish a simple purification method for fibrinolytic enzyme. In this work, we report an arginine or lysine best-affinity purification system of fibrinolytic enzyme for the first time.Compared with the conventional purification methods, this is a simple, inexpensive, and efficient approach for the purification of fibrinolytic enzymes from Sipunculus nudus. The development of this protocol is of greater significance for the further utilization of fibrinolytic enzymes from Sipunculus nudus and other similar agents.

Siguiendo este protocolo, se extrajeron lisados tisulares crudos, se construyeron columnas de cromatografía de afinidad de matriz de arginina-agarosa y matriz de lisina-agarosa, se obtuvo sFE purificado y se midió la pureza y actividad fibrinolítica del sFE purificado mediante placas SDS-PAGE y fibrina, respectivamente.
Después de la centrifugación, el sobrenadante recogido era un líquido viscoso de color canela transparente. La precipitación comenzó cuando este sobrenadante se mezcló...

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Aquí, presentamos un método de purificación de afinidad de una enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus que es simple, económico y eficiente.

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...

Nuestra investigación se centra principalmente en la purificación de la enzima fibrinolítica. Este trabajo trata de establecer un método simple de purificación para la enzima fibrinolítica. En este trabajo, reportamos un sistema de purificación de mejor afinidad de arginina o lisina de la enzima fibrinolítica por primera vez.En comparación con los métodos de purificación convencionales, este es un enfoque simple, económico y eficiente para la purificación de enzimas fibrinolíticas de Sipunculus nudus. El desarrollo de este protocolo es de mayor importancia para la utilización posterior de enzimas fibrinolíticas de Sipunculus nudus y otros agentes similares.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

1.2K vistas.  Huaqiao University. Nuestra investigación se centra principalmente en la purificación de la enzima fibrinolítica. Este trabajo trata de establecer un método simple de purificación para la enzima fibrinolítica. En este trabajo, reportamos un sistema de purificación de mejor afinidad de arginina o lisina de la enzima fibrinolítica por primera vez.En comparación con los métodos de purificación convencionales, este es un enfoque simple, económico y eficiente para la purificación de enzimas fibrin...

Video: Autor destacado: Purificación por afinidad de una enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus  

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin directly, showing great advantages over traditional thrombolytic agents. However, due to the lack of structural information, all the purification programs for sFE are based on multistep chromatography purifications, which are too complicated and costly. Here, an affinity purification protocol of sFE is developed for the first time based on a crystal structure of sFE; it includes preparation of the crude sample and the lysine/arginine-agarose matrix affinity chromatography column, affinity purification, and characterization of the purified sFE. Following this protocol, a batch of sFE can be purified within 1 day. Moreover, the purity and activity of the purified sFE increases to 92% and&#160;19,200 U/mL,&#160;respectively. Thus, this is a simple, inexpensive, and efficient approach for sFE purification. The development of this protocol is of great significance for the further utilization of sFE and other similar agents.

Here, we present an affinity purification method of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus that is simple, inexpensive, and efficient.

Investigación

Bioquímica

Protein Isolation from Sipunculus nudus

Protein Isolation from Sipunculus nudus  

Begin the sample treatment by dissecting 100 grams of fresh Sipunculus nudus and collecting their intestine and inner fluid.Add 300 milliliters of Tris hydrochloride buffer and homogenize at 1000 RPM for 60 seconds.Freeze thaw the homogenate three times.After centrifuging the freeze thawed homogenate, collect the supernatant and store it at 4

Aislamiento proteico de Sipunculus nudus

Affinity Chromatography Mediated Fibrinolytic Enzymes Purification from Crude Protein Extracts 

Filter the crude proteins extracted from the Sipunculus nudus intestine through a 0.22-micrometer filter membrane. Store this sample at four degrees Celsius for later use. Pack the arginine agarose matrix affinity chromatography column by loading the arginine agarose matrix medium into a five-milliliter empty chromatography column.Similarly, load the lysine agarose matrix affinity chromatography column by loading the lysine agarose matrix medium into an empty chromatography column. Equilibrate the affinity chromatography columns with double-distilled water followed by tris hydrochloride buffer. Load the filtered protein sample onto the pre-equilibrated column.Wash the column with five volumes of 0.02-molar tris hydrochloride buffer before eluting it with 0.15-0.25-0.35-0.45-0.55-and 0.65-molar sodium chloride solutions, successively. Once the elution peak appears in the 0.15-molar sodium chloride elution, collect the fractions in five-milliliter tubes. Concentrate the elution sample using a three-kilodalton ultracentrifugal filter and store this sample at minus 80 degrees Celsius for later use.When the protein solution was loaded onto the arginine agarose matrix affinity column, the flow-through peak appeared from approximately 40 to 66 minutes. In the gradient elution stage, elution with 0.15-molar sodium chloride peaked from approximately 94 to 110 minutes. When the protein solution was loaded to the lysine agarose matrix affinity column, the flow-through peak appeared from approximately 38 to 60 minutes.In the gradient elution stage, elution with 0.15-molar sodium chloride peaked from 80 to 86 minutes.

Cromatografía de afinidad Mediada por purificación de enzimas fibrinolíticas a partir de extractos de proteínas crudas 

Fibrinolytic Activity of the Fibrinolytic Enzyme Purified from Sipunculus nudus

Fibrinolytic Activity of the Fibrinolytic Enzyme Purified from  Sipunculus nudus  

Begin the fibrin plate preparation by mixing 25 milligrams of fibrinogen with 1.25 milliliters of physiological saline. Next, prepare the thrombin solution by thoroughly mixing 100 units of thrombin with 1.05 milliliters of physiological saline. Then, prepare the agarose solution by adding 0.5 grams of agarose to 22.5 milliliters of 0.02 molar Tris-hydrochloride acid buffer.Heat the agarose solution at 100 degrees Celsius until it dissolves completely. Cool the agarose solution to around 50 degrees Celsius before adding the fibrinogen solution to it. Immediately add the thrombin solution, mix rapidly, and pour the mixture into a 60-millimeter culture dish.To load the sample, punch three-millimeter wells into the fibrin plates using a sterile Boer, and fill them with 10 microliters of samples. Incubate the plates at 37 degrees Celsius for 18 hours before measuring the size of their degrading zones and calculating the fibrinolytic activity. Fibrinolytic activity evaluation showed a 1.3-centimeter lysing zone in the urokinase control, no lysing zone in the physiological saline buffer, 2.1 centimeters of the lysing zone in the crude protein well, and 1.8 centimeters diameter of the lysing zone in the purified fibrinolytic enzyme well.