Diese Forschung wurde vom Wissenschafts- und Technologiebüro der Stadt Xiamen (3502Z20227197) und dem Wissenschafts- und Technologiebüro der Provinz Fujian (Nr. 2019J01070, Nr. 2021Y0027) finanziert.

1. Vorbereitung
<ol><li>Probenbehandlung<ol><li>Frischen S. nudus (100 g) vorsichtig präparieren und den Darm und seine innere Flüssigkeit auffangen.</li>
		<li>Zur Homogenisierung (1.000 U/min, 60 s) werden 300 ml Tris-HCl-Puffer (0,02 M, pH 7,4) zugegeben.</li>
		<li>Das Homogenat 3x einfrieren und auftauen.</li>
		<li>Die Probe wird zentrifugiert (10.956 × g, 0,5 h, 4 °C) und der Überstand aufgefangen. Lagern Sie die Probe bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Protein-Fällung<ol><li>Mischen Sie den Überstand mit gesättigter Ammoniumsulfatlösung (neun Volumen) und lassen Sie die Mischung 12 h bei 4 °C stehen. HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert und später fortgesetzt werden.</li>
		<li>Zentrifugieren (10.956 × g, 0,5 h, 4 °C), um den Proteinausschlag zu erhalten; Lagern Sie es bei 4 °C für die spätere Verwendung.</li>
	</ol></li>
	<li>Protein-Resuspension<ol><li>Resuspendieren Sie das Proteinpräzipitat mit 30 ml Tris-HCl-Puffer (0,02 M, pH 7,4). Lagern Sie diese Rohproteinlösung für die spätere Verwendung bei 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Affinitätschromatographie
<ol><li>Filtration der Lösung<ol><li>Filtrieren Sie die Rohproteinlösung durch eine 0,22 μm dicke Filtermembran. Bewahren Sie diese Probe zur späteren Verwendung bei 4 °C auf.</li>
	</ol></li>
	<li>Kolonnen-Packung<ol><li>Packen Sie die Arginin-Agarose-Matrix-Affinitätschromatographie-Säule und die Lysin-Agarose-Matrix-Affinitätschromatographie-Säule, indem Sie eine geeignete Menge Lysin-Agarose-Matrixmedium und Arginin-Agarose-Matrix-Matrixmedium in leere 5-ml-Chromatographiesäulen füllen. HINWEIS: Die Säule kann bei 2-8 °C gelagert werden, wobei die Matrix in einen Speicherpuffer (20 % Ethanol) getaucht wird.</li>
	</ol></li>
	<li>Reinigung der Affinität<ol><li>Äquilibrieren Sie die Affinitätschromatographiesäule zuerstmit ddH2O (1 ml/min, 10 Säulenvolumen), gefolgt von Tris-HCl-Puffer (0,02 M, pH 8,0, 1 ml/min, 5 Säulenvolumen).</li>
		<li>Laden Sie die Proteinlösungsprobe auf die voräquilibrierte Säule (1 ml/min, 1/3 Säulenvolumen). HINWEIS: Das Volumen der Probenbeladung hängt von der sFE-Konzentration ab.</li>
		<li>Waschen Sie die Säule mit Tris-HCl-Puffer (0,02 M, pH 8,0, fünf Säulenvolumen).</li>
		<li>Die Säule wird nacheinander mit 0,15 m, 0,25 m, 0,35 m, 0,45 m, 0,55 m und 0,65 m NaCl (1 ml/min, fünf Säulenvolumina) eluiert.</li>
		<li>Suchen Sie nach dem Elutionspeak, der in der 0,15 M NaCl-Elution erscheinen sollte, und sammeln Sie dann die Fraktionen in 5-ml-Röhrchen.</li>
		<li>Die Elutionsprobe wird mit einem 3 kD Ultrazentrifugalfilter (3.944 × g, 1,5 h, 4 °C) konzentriert. Lagern Sie diese Probe zur späteren Verwendung bei -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Bewertung der Reinheit
<ol><li>Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Gelpräparation (SDS-PAGE)<ol><li>Bereiten Sie das SDS-PAGE-Gel nach der Laemmli-Methode mit 5 % konzentriertem Gel und 12 % Trenngel13 vor.</li>
	</ol></li>
	<li>Elektrophorese<ol><li>Mischen Sie die Probe (15 μL) mit 5x SDS-PAGE-Proteinladepuffer (1/4 Volumen), erhitzen Sie sie 5 min lang in kochendem Wasser, laden Sie sie auf das SDS-PAGE-Gel und lassen Sie das Gel 1,5 h lang bei 80 V, 60 mA laufen.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse<ol><li>Färben Sie das Gel nach der Elektrophorese mit einem Silberfärbe-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers und beobachten Sie das gefärbte Gel mit einem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem.</li>
		<li>Analysieren Sie die Reinheit des Zielproteins mit der folgenden Formel: Reinheit des Zielproteins = Intensitätswert des Zielproteins / Intensitätswert des Gesamtproteins.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Bewertung der fibrinolytischen Aktivität
<ol><li>Vorbereitung der Fibrinplatte<ol><li>Bereiten Sie die Fibrinogenlösung vor, indem Sie 25 mg Fibrinogen mit 1,25 ml physiologischer Kochsalzlösung mischen.</li>
		<li>Bereiten Sie die Thrombinlösung vor, indem Sie 100 U Thrombin vollständig mit 1,05 ml physiologischer Kochsalzlösung mischen.</li>
		<li>Bereiten Sie die Agaroselösung vor, indem Sie 0,5 g Agarose zu 22,5 ml Tris-HCl-Puffer (0,02 mol/l, pH 7,4) hinzufügen. Mischen und erhitzen Sie die Agaroselösung bei 100 °C, bis sie sich vollständig aufgelöst hat.</li>
		<li>Die Agaroselösung auf ca. 50 °C abkühlen lassen und Fibrinogenlösung zugeben. Fügen Sie dann sofort die Thrombinlösung hinzu, mischen Sie sie schnell und gießen Sie sie in eine 60-mm-Kulturschale.</li>
	</ol></li>
	<li>Laden<ol><li>Stanzen Sie mit einem sterilen Bohrer 3 mm Wells auf die vorbereiteten Fibrinplatten und füllen Sie die Wells mit 10 μL Proben.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse<ol><li>Messen Sie nach 18 Stunden Inkubation bei 37 °C die fibrinolytische Aktivität, indem Sie die Größe ihrer Abbauzonen berechnen. Fibrinolytische Aktivität = (Zonengröße der Probe/Zonengröße der Urokinase) x 100 U. Zonengröße = Durchmesser x Durchmesser. ANMERKUNG: Physiologischer Kochsalzpuffer, Rohprotein (Probe aus Protokollschritt 1.3.1) und Urokinase wurden für die Blind-, Negativ- bzw. Positivkontrolle verwendet. Im Vergleich zur Urokinase fanden wir heraus, dass die fibrinolytische Aktivität der gereinigten sFE ~19.200 U/ml betrug.</li>
	</ol></li>
</ol>

Aufreinigung eines fibrinolytischen Enzyms aus Sipunculus nudus mittels Affinitätschromatographie

<ol>
	<li>Rosell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patients+with+COVID-19+have+elevated+levels+of+circulating+extracellular+vesicle+tissue+factor+activity+that+is+associated+with+severity+and+mortality-brief+report.">Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).</li><li>Schultz, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombosis+and+thrombocytopenia+after+ChAdOx1+nCoV-19+vaccination.+The+New+England.">Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England.</a> Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).</li><li>von Kaulla, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urokinase-induced+fibrinolysis+of+human+standard+clots.">Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots.</a> Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).</li><li>Van de Werf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+thrombolysis+with+tissue-type+plasminogen+activator+in+patients+with+evolving+myocardial+infarction.">Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction.</a> The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).</li><li>Schaller, J., Gerber, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasmin-antiplasmin+system:+structural+and+functional+aspects.">The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).</li><li>Ge, Y. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+antithrombotic+protease+from+marine+worm+Sipunculus+nudus.">A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+novel+fibrinolytic+enzyme+from+culture+supernatant+of+Pleurotus+ostreatus.">Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).</li><li>Choi, J. -. H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starase:+A+bi-functional+fibrinolytic+protease+from+hepatic+caeca+of+Asterina+pectinifera+displays+antithrombotic+potential.">Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential.</a> Biochimie. 105, 45-57 (2014).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fibrinolytic+protein+From+Pheretima+vulgaris:+purification,+identification,+antithrombotic+evaluation,+and+mechanisms+investigation.">A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419 (2022).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant,+hypolipidemic+and+hepatic+protective+activities+of+polysaccharides+from+Phascolosoma+esculenta.">Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta.</a> Marine Drugs. 18 (3), 158 (2020).</li><li>. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm Available from: <a target="_blank" href="https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en">https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en</a> (2019)</li><li>Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+expressed+differentially+in+female+and+male+gametes+of+Sipunculus+nudus.">Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus.</a> Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).</li><li>Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+renature+DNA-binding+proteins+separated+by+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis.">A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).</li><li>Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+barcoding+reveals+cryptic+diversity+in+the+peanut+worm+Sipunculus+nudus.">DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus.</a> Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).</li><li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen-plasmin+system.+I.+Purification+and+properties+of+human+plasminogen.">Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).</li><li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen-plasmin+system.+II.+Purification+and+properties+of+human+plasmin.">Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).</li><li>Wiman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-chromatographic+purification+of+human+&#945;2-antiplasmin.">Affinity-chromatographic purification of human &#945;2-antiplasmin.</a> The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).</li><li>Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+purification+and+characterization+of+a+new+fast-acting+plasmin+inhibitor+from+human+platelets.+Evidence+for+non-identity+with+the+known+plasma+proteinase+inhibitors.">Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors.</a> The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).</li><li>Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+human+plasma/cellular+fibronectin+and+fibronectin+fragments.">Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments.</a> Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).</li><li>Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+and+purification+of+human+recombinant+tissue+type+plasminogen+activator+(rt-PA)+from+transgenic+tobacco+plants.">Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants.</a> Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).</li><li>Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+abnormalities+of+human+plasminogen+isolated+from+synovial+fluid+of+rheumatoid+arthritis+patients.">Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients.</a> Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Da die exakte Gensequenz von sFE nicht verfügbar war, wurde die derzeit verwendete sFE aus frischem S. nudus14 extrahiert. Darüber hinaus waren die in der Literatur beschriebenen Reinigungsverfahren von sFE kompliziert und kostspielig, da sie auf einigen allgemeinen Merkmalen von sFE basierten, wie z. B. Molekulargewicht, isoelektrischer Punkt, Ionenstärke und Polarität15,16. Bisher wurde kein Affinitätsreinigungsprotokoll vo...

Thrombosen stellen eine große Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar, insbesondere nach der globalen Covid-19-Pandemie 1,2. Klinisch werden viele Plasminogenaktivatoren (PAs), wie z. B. Gewebetyp-Plasminogenaktivatoren (tPA) und Urokinase (UK), häufig als thrombolytische Arzneimittel eingesetzt. PAs können das Plasminogen des Patienten in aktives Plasmin aktivieren, um Fibrin abzubauen. Daher ist ihre thrombolytische Effizienz durch den Plasminogenstatus der Patienten stark eingeschränkt 3,4. Fibrinolytika wie Metalloproteinase-Plasmin und Serin-Plasmin sind eine weitere Art von klinischen thrombolytischen Arzneimitteln, zu denen auch fibrinolytische Enzyme (FE) wie Plasmin gehören, die Gerinnsel direkt auflösen können, aber durch verschiedene Plasmininhibitoren schnell inaktiviert werden5. In der Folge wurde über eine neuartige Art von Fibrinolytikum berichtet, das den Thrombus auflösen kann, indem es nicht nur das Plasminogen in Plasmin aktiviert, sondern auch das Fibrindirekt abbaut 6-das fibrinolytische Enzym aus dem alten Erdnusswurm Sipunculus nudus (sFE)6. Diese Bifunktion verleiht sFE weitere Vorteile gegenüber herkömmlichen Thrombolytika, insbesondere in Bezug auf den abnormen Plasminogenstatus. Im Vergleich zu anderen bifunktionellen Fibrinolytika 7,8,9 weist sFE mehrere Vorteile, einschließlich der Sicherheit, gegenüber Non-Food-Wirkstoffen für die Arzneimittelentwicklung, insbesondere für orale Arzneimittel, auf. Dies liegt daran, dass die biologische Sicherheit und Biokompatibilität von Sipunculus nudus gut belegt sind10.
Ähnlich wie bei den anderen natürlichen Fibrinolytika, die aus Mikroorganismen, Regenwürmern und Pilzen isoliert werden, ist die Reinigung von sFE aus S. nudus sehr kompliziert und umfasst mehrere Stufen wie Gewebehomogenisierung, Ammoniumsulfatausfällung, Entsalzung, Anionenaustauschchromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie und Molekularsiebung10,11,12. Ein solches Reinigungssystem hängt nicht nur von kompetenten Fähigkeiten und teuren Materialien ab, sondern benötigt auch mehrere Tage, um das gesamte Verfahren abzuschließen. Daher ist ein einfaches Reinigungsprogramm von sFE von großer Bedeutung für die weitere Entwicklung von sFE. Glücklicherweise konnten zwei Kristalle von sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) erfolgreich erhalten wurden (siehe Ergänzungsdatei 1 und Ergänzungsdatei 2). Durch Strukturanalysen und molekulare Docking-Experimente fanden wir heraus, dass der katalytische Kern von sFE spezifisch an Targets binden kann, die Arginin- oder Lysinreste enthalten.
In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal ein Affinitätsreinigungssystem vorgeschlagen, das auf der Kristallstruktur von sFE basiert. Durch die Befolgung dieses Protokolls konnte hochreines und hochaktives sFE aus den Rohextrakten in einer einzigen Affinitätsreinigungsstufe gereinigt werden. Das hier entwickelte Protokoll ist nicht nur für die großtechnische Herstellung von sFE wichtig, sondern kann auch für die Aufreinigung anderer Fibrinolytika eingesetzt werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose G-10</td>
			<td>Biowest</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine-Sepharose 4B</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Arginine-agarose matrix</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromoxylenol Blue (BPB)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Silver Stain Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinase</td>
			<td>RHAWN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine-Sepharose 4B</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Lysine-agarose matrix</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Color Protein Marker (10-170 kD)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT Aprotein Purification System pure</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750</td>
			<td>SANYO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence Imaging System</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Flow Pump BT-100</td>
			<td>QITE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Temperature Incubator</td>
			<td>JINGHONG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD</td>
			<td>SENXIN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric Glass Homogenizer DY89-II</td>
			<td>SCIENTZ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Analytical Balance</td>
			<td>DENVER</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12</td>
			<td>SENXIN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal Decolorization Shaker</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Machine AF 103</td>
			<td>Scotsman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KQ-500E Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>ShuMei</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer</td>
			<td>Zhi wei</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W</td>
			<td>Cence</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave Oven</td>
			<td>Galanz</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Reference</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Desktop pH Meter</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small-sized Vortex Oscillator</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Electrophoresis System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumable Material&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L PCR Tube (200 &#181;L)</td>
			<td>Axygene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube (1.5 mL)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube (5 mL)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube (50 mL)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube (7 mL)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Dish (60 mm)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Membrane (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millex GP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tip (1 mL )</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tip (10 &#181;L)</td>
			<td>Axygene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tip (200 &#181;L)</td>
			<td>Axygene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special Indicator Paper</td>
			<td>TZAKZY</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal pH Indicator</td>
			<td>SSS Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
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affinity purification of a fibrinolytic enzyme from sipunculus nudus

Das fibrinolytische Enzym aus Sipunculus nudus (sFE) ist ein neuartiges Fibrinolytikum, das sowohl Plasminogen zu Plasmin aktivieren als auch Fibrin direkt abbauen kann, was große Vorteile gegenüber herkömmlichen Thrombolytika aufweist. Aufgrund des Mangels an strukturellen Informationen basieren jedoch alle Aufreinigungsprogramme für sFE auf mehrstufigen chromatographischen Aufreinigungen, die zu kompliziert und kostspielig sind. In dieser Arbeit wird erstmalig ein Affinitätsreinigungsprotokoll von sFE entwickelt, das auf einer Kristallstruktur von sFE basiert; Es umfasst die Vorbereitung der Rohprobe und der Lysin/Arginin-Agarose-Matrix-Affinitätschromatographie-Säule, die Affinitätsreinigung und die Charakterisierung der gereinigten sFE. Nach diesem Protokoll kann eine Charge sFE innerhalb von 1 Tag gereinigt werden. Darüber hinaus erhöht sich die Reinheit und Aktivität des gereinigten sFE auf 92 % bzw. 19.200 U/ml. Somit ist dies ein einfacher, kostengünstiger und effizienter Ansatz für die sFE-Reinigung. Die Entwicklung dieses Protokolls ist von großer Bedeutung für die weitere Verwendung von sFE und anderen ähnlichen Wirkstoffen.

Thrombosis is a major threat to public health, especially following the Covid-19 global pandemic1,2. Clinically, many plasminogen activators (PAs), such as tissue-type plasminogen activator (tPA) and urokinase (UK), have been widely used as thrombolytic drugs. PAs can activate patients&#39; plasminogen into active plasmin to degrade fibrin. Thus, their thrombolytic efficiency is heavily restricted by the patients&#39; plasminogen status3,4. Fibrinolytic agents, such as metalloproteinase plasmin and serine plasmin, are another type of clinical thrombolytic drug that also include fibrinolytic enzymes (FE) such as plasmin, which can dissolve clots directly but are quickly inactivated by various plasmin inhibitors5. Subsequently, a novel type of fibrinolytic agent has been reported that can dissolve the thrombus by not only activating the plasminogen into plasmin but also degrading the fibrin directly6-the fibrinolytic enzyme from the ancient peanut worm Sipunculus nudus (sFE)6. This bifunction endows sFE other advantages over traditional thrombolytic drugs, especially in terms of abnormal plasminogen status. Compared with other bifunctional fibrinolytic agents7,8,9, sFE displays several advantages, including safety, over non-food derived agents for drug development, especially for oral drugs. This is because the biosafety and biocompatibility of Sipunculus nudus have been well-established10.
Similar to the other natural fibrinolytic agents isolated from microorganisms, earthworms, and mushrooms, the purification of sFE from S. nudus is very complicated and includes multiple stages, such as tissue homogenization, ammonium sulphate precipitation, desalination, anion-exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, and molecular sieving10,11,12. Such a purification system not only depends on proficient skills and expensive materials, but also requires several days to complete the whole procedure. Therefore, a simple purification program of sFE is of great significance for the further development of sFE. Fortunately, two crystals of sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) have been successfully obtained (see Supplemental File 1 and Supplemental File 2). Through structural analysis and molecular docking experiments, we found that the catalytic core of sFE could specifically bind to targets containing arginine or lysine residues.
Herein, an affinity purification system was proposed for the first time, based on the crystal structure of sFE. By following this protocol, highly pure and highly active sFE could be purified from the crude extracts in a single affinity purification stage. The protocol developed here is not only important for the large scale preparation of sFE, but also may be applied for the purification of other fibrinolytic agents.

Autor im Rampenlicht: Affinitätsreinigung eines fibrinolytischen Enzyms aus Sipunculus nudus  

Affinitätsreinigung eines fibrinolytischen Enzyms aus Sipunculus nudus

Nach diesem Protokoll wurden Rohgewebelysate extrahiert, Arginin-Agarose-Matrix- und Lysin-Agarose-Matrix-Affinitätschromatographie-Säulen gebaut, gereinigte sFE erhalten und die Reinheit und fibrinolytische Aktivität der gereinigten sFE mit SDS-PAGE- bzw. Fibrinplatten gemessen.
Nach der Zentrifugation war der gesammelte Überstand eine durchsichtige, hellbraune, viskose Flüssigkeit. Die Ausfällung begann, wenn dieser Überstand mit gesättigter Ammoniumsulfatlösung (neun Volumen) gemis...

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Hier stellen wir eine Affinitätsreinigungsmethode eines fibrinolytischen Enzyms aus Sipunculus nudus vor, die einfach, kostengünstig und effizient ist.

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...

Unsere Forschung befasst sich hauptsächlich mit der Reinigung von fibrinolytischen Enzymen. In dieser Arbeit wird versucht, eine einfache Reinigungsmethode für fibrinolytische Enzyme zu etablieren. In dieser Arbeit berichten wir zum ersten Mal über ein Arginin- oder Lysin-Best-Affinitäts-Reinigungssystem des fibrinolytischen Enzyms.Im Vergleich zu den herkömmlichen Reinigungsmethoden ist dies ein einfacher, kostengünstiger und effizienter Ansatz zur Aufreinigung von fibrinolytischen Enzymen aus Sipunculus nudus. Die Entwicklung dieses Protokolls ist von größerer Bedeutung für die weitere Nutzung von fibrinolytischen Enzymen aus Sipunculus nudus und anderen ähnlichen Wirkstoffen.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

1.2K Aufrufe.  Huaqiao University. Unsere Forschung befasst sich hauptsächlich mit der Reinigung von fibrinolytischen Enzymen. In dieser Arbeit wird versucht, eine einfache Reinigungsmethode für fibrinolytische Enzyme zu etablieren. In dieser Arbeit berichten wir zum ersten Mal über ein Arginin- oder Lysin-Best-Affinitäts-Reinigungssystem des fibrinolytischen Enzyms.Im Vergleich zu den herkömmlichen Reinigungsmethoden ist dies ein einfacher, kostengünstiger und effizienter Ansatz zur Aufreinigung von fibrinolytisc...

Serie: Autor im Rampenlicht: Affinitätsreinigung eines fibrinolytischen Enzyms aus Sipunculus nudus  

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin directly, showing great advantages over traditional thrombolytic agents. However, due to the lack of structural information, all the purification programs for sFE are based on multistep chromatography purifications, which are too complicated and costly. Here, an affinity purification protocol of sFE is developed for the first time based on a crystal structure of sFE; it includes preparation of the crude sample and the lysine/arginine-agarose matrix affinity chromatography column, affinity purification, and characterization of the purified sFE. Following this protocol, a batch of sFE can be purified within 1 day. Moreover, the purity and activity of the purified sFE increases to 92% and&#160;19,200 U/mL,&#160;respectively. Thus, this is a simple, inexpensive, and efficient approach for sFE purification. The development of this protocol is of great significance for the further utilization of sFE and other similar agents.

Here, we present an affinity purification method of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus that is simple, inexpensive, and efficient.