Agradecemos al Dr. Xiao Fan por sus útiles discusiones al establecer estos métodos en Scripps Research. B.B. recibió el apoyo de una beca de investigación postdoctoral de la Fundación Hewitt para la Investigación Médica. W.C. cuenta con el apoyo de una beca predoctoral de la Fundación Nacional de Ciencias. D.E.P cuenta con el apoyo de la subvención de los Institutos Nacionales de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) NS095892 a G.C.L. Este proyecto también contó con el apoyo de subvenciones de los NIH GM142196, GM143805 y S10OD032467 a G.C.L.

Recubrimiento de rejillas TEM con una monocapa de grafeno

<ol>
	<li>Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. 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F., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+individual+atoms+of+protein+complex+by+cryo-electron+microscopy.">Resolving individual atoms of protein complex by cryo-electron microscopy.</a> Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).</li><li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM.">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).</li><li>Schultz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens.">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).</li><li>Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opinion:+hazards+faced+by+macromolecules+when+confined+to+thin+aqueous+films.">Opinion: hazards faced by macromolecules when confined to thin aqueous films.</a> Biophysics Reports. 3 (1-3), 1-7 (2017).</li><li>Han, B. G., Watson, Z., Cate, J. H. D., Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer-crystal+streptavidin+support+films+provide+an+internal+standard+of+cryo-EM+image+quality.">Monolayer-crystal streptavidin support films provide an internal standard of cryo-EM image quality.</a> Journal of Structural Biology. 200 (3), 307-313 (2017).</li><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography.">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> eLife. 7, 1-42 (2018).</li><li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation.">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).</li><li>Liu, N., Wang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Better+cryo-EM+specimen+preparation:+how+to+deal+with+the+air-water+interface.">Better cryo-EM specimen preparation: how to deal with the air-water interface.</a> Journal of Molecular Biology. 435 (9), 167926 (2022).</li><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+effects+of+particle+adsorption+to+the+air-water+interface+in+cryo-EM.">Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM.</a> Nature Methods. 15 (10), 793-795 (2018).</li><li>Palovcak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+robust+procedure+for+preparing+graphene-oxide+cryo-EM+grids.">A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).</li><li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids.">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+carbon+films+with+~500nm+holes+for+cryo-EM+with+a+direct+detector+device.">Fabrication of carbon films with ~500nm holes for cryo-EM with a direct detector device.</a> Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).</li><li>Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphene+oxide:+A+substrate+for+optimizing+preparations+of+frozen-hydrated+samples.">Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples.</a> Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).</li><li>Pantelic, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphene:+substrate+preparation+and+introduction.">Graphene: substrate preparation and introduction.</a> Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).</li><li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+an+optimal+specimen+support+for+electron+cryomicroscopy.">Progress towards an optimal specimen support for electron cryomicroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 37, 81-89 (2016).</li><li>Passmore, L. A., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specimen+preparation+for+high-resolution+cryo-EM.">Specimen preparation for high-resolution cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+monolayer+graphene+grids+for+near-atomic+resolution+cryoelectron+microscopy.">High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).</li><li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+ultraclean+atomically+thin+membranes+for+atomic-resolution+electron+microscopy.">Robust ultraclean atomically thin membranes for atomic-resolution electron microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 541 (2020).</li><li>Ahn, E., Kim, B., Cho, U. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Batch+production+of+high-quality+graphene+grids+for+cryo-EM:+cryo-EM+structure+of+Methylococcus+capsulatus+soluble+methane+monooxygenase+hydroxylase.">Batch production of high-quality graphene grids for cryo-EM: cryo-EM structure of Methylococcus capsulatus soluble methane monooxygenase hydroxylase.</a> bioRxiv. (Cvd), (2021).</li><li>Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy.">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li><li>Fan, H., Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+graphene+grids+for+cryoelectron+microscopy.">Developing graphene grids for cryoelectron microscopy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 937253 (2022).</li><li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it.">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> eLife. 8, e42747 (2019).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+copper+step+beams+during+graphene+growth+by+CVD+method.">Evolution of copper step beams during graphene growth by CVD method.</a> Applied Surface Science. 610, 155518 (2023).</li><li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+thin+ice+on+ultraflat+graphene+for+high-resolution+cryo-EM.">Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM.</a> Nature Methods. 20 (1), 123-130 (2023).</li><li>Fujita, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxidized+graphene+grid+for+highly+efficient+high-resolution+cryoEM+structural+analysis.">Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis.</a> Scientific Reports. 13, 2279 (2023).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalized+graphene+grids+with+various+charges+for+single-particle+cryo-EM.">Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM.</a> Nature Communications. 13, 6718 (2022).</li></ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

La conservación de muestras biológicas en una fina capa de hielo vítreo es un paso de importancia crítica para la determinación de la estructura crioEM de alta resolución. Sin embargo, los investigadores a menudo se encuentran con problemas derivados de las interacciones con el AWI, que introduce la orientación preferida, el desmontaje complejo, la desnaturalización y la agregación. Además, las muestras no siempre pueden concentrarse lo suficiente como para poblar el hielo delgado suspendido a través de los agujeros de una película fenestrada. Varios grupos de investigación han desarrollado métodos para recubrir las rejillas EM con una monocapa de grafeno para ayudar a superar algunas de estas limitaciones 24,25,26,27,28,29,30, y las rejillas de grafeno se han utilizado con gran éxito. Aquí, proporcionamos instrucciones paso a paso para preparar de manera efectiva lotes de rejillas de grafeno internamente y examinar la calidad de las rejillas de grafeno por TEM. Hacemos hincapié en que se debe tener especial cuidado durante algunos de los pasos críticos, que describimos a continuación.
El grafeno tiene una fuerte tendencia a atraer contaminantes en el aire. Por lo tanto, durante el proceso de fabricación de la rejilla de grafeno, es importante asegurarse de que todas las herramientas que entran en contacto con la lámina de grafeno/Cu o las rejillas estén limpias y libres de polvo. Los cubreobjetos de vidrio utilizados para transferir grafeno se pueden limpiar enjuagándolos con etanol y agua desionizada o usando un plumero de aire. También se recomienda trabajar bajo una campana extractora y mantener las láminas y rejillas de grafeno cubiertas con papel de aluminio o una placa de vidrio limpia en todo momento. El polvo o los contaminantes en las rejillas pueden impedir que el grafeno se adhiera completamente a las rejillas EM. Cuando se manipulan rejillas de grafeno o recubiertas de grafeno, es importante estar conectado a tierra eléctricamente para evitar daños a la película de grafeno por descarga estática. La descarga estática puede evitarse utilizando una correa de conexión a tierra para la muñeca, tocando un objeto metálico conectado a tierra cada vez que se manipulan grafeno o rejillas de grafeno y/o no usando un guante en la mano que sostiene las pinzas24.
Dado que una monocapa de grafeno es muy delgada (del ancho de un átomo de carbono), es importante apoyar el grafeno con una capa orgánica como MMA o poli-MMA (PMMA) durante la transferencia de grafeno a las rejillas. El PMMA es el material más utilizado para la transferencia de grafeno. Sin embargo, el PMMA tiene una fuerte afinidad con el grafeno y, a menudo, puede provocar la contaminación del polímero en la película de grafeno. En este protocolo se utiliza MMA, ya que deja menos contaminación residual25. Sin embargo, tanto el PMMA como el MMA tienen la desventaja de formar arrugas y grietas que se pueden observar en algunas áreas de la película de grafeno (Figura 3B). Puede ser un desafío evitar estas arrugas, ya que ocurren comúnmente durante el crecimiento del grafeno por el método CVD31. Recientemente se ha desarrollado un método para cultivar grafeno ultraplano sin arrugas, en el que la lámina de cobre se sustituye por una oblea de Cu(111)/zafiro como sustrato de crecimiento32.
Según nuestra experiencia, es mejor comprar láminas de grafeno/Cu y respaldar el grafeno con MMA internamente que comprar láminas de Cu-grafeno cubiertas de polímero de los fabricantes, que se vuelven quebradizas después del grabado de cobre y son difíciles de manejar en los pasos posteriores. El barnizador giratorio que utilizamos para el recubrimiento de MMA se puede construir de forma económica utilizando piezas de una tienda local de computadoras/hardware, como se describió anteriormente25.
Durante el paso del recubrimiento de MMA, es importante cubrir la totalidad de la superficie de grafeno en la lámina de Cu-grafeno con MMA. Después de que el Cu haya sido grabado, el grafeno MMA se volverá semitransparente, y las áreas que carecen de cobertura MMA se verán como agujeros vacíos. Para evitar el recubrimiento de MMA en el lado de cobre, es importante colocar un pequeño trozo de papel secante debajo de él durante el recubrimiento para que absorba cualquier exceso de MMA que salga de la película CVD.
Después del grabado y el enjuague, la lámina de MMA/grafeno está lista para ser transferida a las rejillas EM mediante el uso de un sistema de canal comercial o casero con una jeringa o bomba peristáltica para controlar el nivel del agua. Antes del paso de transferencia, es importante enjuagar bien las rejillas en baños sucesivos de cloroformo, acetona e IPA. Hornear rejillas recubiertas de grafeno a 65 °C ayuda a preservar la integridad del grafeno y promueve la adsorción de grafeno a las rejillas. Por último, para evitar la contaminación por MMA en las rejillas, es importante eliminar completamente la MMA en un baño de acetona y limpiar las rejillas en IPA. Cualquier residuo de MMA sin lavar se observará en las rejillas EM y disminuirá la relación señal-ruido de las imágenes (Figura 3C). El proceso de lavado con acetona-IPA se puede repetir para limpiar aún más las superficies de grafeno.
Para hacer que las cuadrículas de grafeno sean hidrófilas, expusimos las cuadrículas a UV/Ozono. Los diferentes modelos de limpiadores UV/ozono pueden requerir optimización para oxigenar suficientemente la capa de grafeno para la preparación de muestras crioEM sin dañar el grafeno. Independientemente del sistema, es fundamental utilizar estas rejillas para la aplicación de muestras crioEM inmediatamente después del tratamiento UV/Ozono. En otros estudios se describen métodos alternativos para hacer hidrofílicas las mallas de grafeno33,34.

La microscopía electrónica criogénica de una sola partícula (crioEM) es una tecnología cada vez más aplicable que se utiliza para investigar las estructuras 3D de las biomacromoléculas. Los avances tecnológicos en la óptica del microscopio electrónico, la detección directa de electrones1 y los algoritmos informáticos 2,3,4 durante la última década han permitido a los usuarios de crioEM determinar las estructuras de complejos macromoleculares bioquímicamente estables con una resolución casi atómica 5,6,7,8 . A pesar de estos avances, siguen existiendo barreras notables para la preservación de muestras para la obtención de imágenes crioEM, que impiden que la mayoría de las muestras biológicas se resuelvan a resoluciones tan altas.
La preparación de muestras para el análisis crioEM de alta resolución implica atrapar macromoléculas que se distribuyen uniformemente en una amplia gama de orientaciones dentro de una fina capa de hielo vitrificado. Los métodos de congelación "blot and plunge" son los métodos más utilizados para generar películas delgadas de muestras biológicas en cuadrículas para estudios de crioEM 9,10. Estos métodos consisten en aplicar unos pocos microlitros de solución de muestra a una rejilla EM que contiene una película fenestrada que se ha hecho hidrófila y, posteriormente, borrar la mayor parte de la muestra con papel de filtro antes de sumergir rápidamente la rejilla en un criógeno de etano líquido o mezcla de etano y propano9.
Si bien este método se ha utilizado con éxito para determinar las estructuras de una amplia gama de especímenes biológicos, todos los métodos de preparación de especímenes crioEM comúnmente utilizados exponen los especímenes a la interfaz hidrofóbica aire-agua (AWI), que a menudo presenta problemas que limitan la determinación de estructuras de alta resolución. Se ha establecido que los especímenes biológicos tienen una alta propensión a la desnaturalización cuando se exponen al AWI, lo que puede conducir a una agregación y desensamblaje complejos11,12,13,14. Además, los parches hidrofóbicos en las superficies de los especímenes biológicos hacen que las partículas adopten las orientaciones preferidas en el hielo12. En muchos escenarios, una sola región hidrofóbica de la muestra obliga a todas las partículas a adoptar una orientación singular en el hielo, aboliendo así la capacidad de generar una reconstrucción fiable. Además de los problemas con el AWI, los especímenes pueden demostrar una afinidad por la superficie de la capa de película fenestrada, lo que limita el número de partículas suspendidas en el hielo dentro de los agujeros15.
Se han desarrollado varias soluciones metodológicas y tecnológicas para disminuir estos problemas que surgen de las interacciones con el AWI o las películas16,17. Un enfoque popular es recubrir la película fenestrada de las rejillas EM con una capa delgada (decenas de nanómetros) de carbono amorfo. Este recubrimiento proporciona una superficie continua a través de los orificios a la que las partículas pueden adsorberse, con el beneficio de proteger parcialmente la muestra de las interacciones con el AWI15,18,19,20. Sin embargo, la capa adicional de carbono eleva la cantidad de señal de fondo en las regiones fotografiadas, introduciendo ruido que puede comprometer la resolución alcanzable, particularmente para muestras pequeñas (<150 kDa). En los últimos años, se ha demostrado que el uso de escamas de óxido de grafeno (GO) para producir películas de soporte en rejillas crioEM tiene ventajas sobre el carbono amorfo tradicional. Las escamas de GO se producen a través de la oxidación de las capas de grafito, lo que da como resultado láminas pseudocristalinas de grafito monocapa que son hidrófilas debido a su contenido sustancial de oxígeno en forma de grupos carboxilo, hidroxilo y epoxi en las superficies y bordes. Las escamas comerciales de GO en suspensiones acuosas son baratas, y existen numerosos métodos publicados para aplicar escamas de GO a las rejillas EM18,21. Sin embargo, estos métodos a menudo dan como resultado cuadrículas que solo están parcialmente cubiertas con copos de GO, así como regiones que contienen varias capas de copos de GO. Además, las escamas de GO contribuyen con una señal de fondo notable a las imágenes crioEM que es cercana a la observada con el carbono amorfo delgado22,23.
El grafeno monocapa prístino, que consiste en una sola matriz cristalina 2D de átomos de carbono, se distingue del GO en que no produce contraste de fase en el microscopio electrónico. Por lo tanto, el grafeno monocapa se puede utilizar para generar una capa de soporte invisible para obtener imágenes de muestras biológicas. El grafeno monocapa también es más fuerte que el GO y se puede aplicar como una sola monocapa en una rejilla EM, y los avances recientes en la fabricación de rejillas EM recubiertas de grafeno han hecho posible preparar rejillas de grafeno monocapa de alta cobertura internamente 24,25,26,27,28,29,30 . Sin embargo, a pesar de los beneficios del uso de rejillas recubiertas de grafeno para la determinación de la estructura crioEM, no se utilizan ampliamente debido al costo prohibitivo de las opciones comerciales y la complejidad de la producción interna. Aquí, describimos una guía paso a paso para producir de manera efectiva rejillas EM cubiertas con una monocapa de grafeno para la determinación de la estructura crioEM de muestras biológicas (Figura 1). Siguiendo este protocolo detallado, los investigadores de cryoEM pueden preparar de forma reproducible docenas de rejillas de soporte de grafeno de alta calidad en un solo día. La calidad de las rejillas recubiertas de grafeno se puede examinar fácilmente utilizando un microscopio electrónico de transmisión (TEM) de gama baja equipado con un filamento LaB6.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70% EtOH</td>
			<td>Pharmco (190 pf EtOH)</td>
			<td>241000190CSGL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650501-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>215589-500g</td>
			<td>Hazardous; use extreme caution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2432-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamping TEM Grid Holder Block for 45 Grids</td>
			<td>PELCO</td>
			<td>16830-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer fan</td>
			<td>Amazon (Noctua)</td>
			<td>B07CG2PGY6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>Bellco Glass</td>
			<td>1203J71</td>
			<td>Standard cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallizing dish</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>3140-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronics duster</td>
			<td>Falcon Safety Products</td>
			<td>75-37-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Dust-off Air Duster</td>
			<td>Staples</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter papers</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip tweezer</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0508-L4-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4980-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fork</td>
			<td>Supermarket</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphene/Cu</td>
			<td>Graphenea</td>
			<td>N/A</td>
			<td>CVD monolayer graphene cu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid Coating Trough</td>
			<td>Ladd Research Industries</td>
			<td>10840</td>
			<td>Fragile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton Tape</td>
			<td>Amazon (MYJOR)</td>
			<td>MY-RZY001</td>
			<td>Polyimide tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long twzeer</td>
			<td>Cole Parmer Essentials</td>
			<td>UX-07387-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal grid holder</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16820-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMA(8.5)MMA EL 6</td>
			<td>KAYAKU Advanced Materials</td>
			<td>M31006 0500L 1GL</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 10 Lab Oven</td>
			<td>Quincy Lab, Inc.</td>
			<td>FO19013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>3610-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner (Solarus 950)</td>
			<td>Gatan, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fiskars</td>
			<td>194813-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Analog Orbital Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltrAuFoil R1.2/1.3 - Au300</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Holey gold grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet Ozone Cleaning Systems</td>
			<td>UVOCS</td>
			<td>model T10X10/OES</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of monolayer graphene-coated grids for cryoelectron microscopy

La microscopía electrónica criogénica (crioEM) se ha convertido en una técnica poderosa para sondear la estructura atómica de los complejos macromoleculares. La preparación de muestras para crioEM requiere la conservación de las muestras en una capa delgada de hielo vítreo, generalmente suspendida dentro de los orificios de una película de soporte fenestrada. Sin embargo, todos los enfoques de preparación de muestras comúnmente utilizados para los estudios de crioEM exponen la muestra a la interfaz aire-agua, lo que introduce un fuerte efecto hidrofóbico en la muestra que a menudo resulta en desnaturalización, agregación y disociación compleja. Además, las interacciones hidrofóbicas preferidas entre las regiones de la muestra y la interfaz aire-agua afectan a las orientaciones adoptadas por las macromoléculas, lo que da lugar a reconstrucciones 3D con resolución direccional anisotrópica. 
Se ha demostrado que la adsorción de muestras crioEM a una monocapa de grafeno ayuda a mitigar las interacciones con la interfaz aire-agua, al tiempo que minimiza la introducción de ruido de fondo. Los soportes de grafeno también ofrecen la ventaja de reducir sustancialmente la concentración requerida de proteínas requeridas para la obtención de imágenes crioEM. A pesar de las ventajas de estos soportes, las rejillas recubiertas de grafeno no son ampliamente utilizadas por la comunidad crioEM debido al costo prohibitivo de las opciones comerciales y los desafíos asociados con la producción interna a gran escala. Este artículo describe un método eficiente para preparar lotes de rejillas crioEM que tienen una cobertura casi total de grafeno monocapa.

Single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) is an increasingly applicable technology used to investigate the 3D structures of biomacromolecules. Technological advances in electron microscope optics, direct electron detection1, and computer algorithms2,3,4 over the past decade have enabled cryoEM users to determine the structures of biochemically stable macromolecular complexes to near-atomic resolution5,6,7,8. Despite these advances, there remain notable barriers to preserving samples for cryoEM imaging, which prevent the majority of biological specimens from being resolved to such high resolutions.
Sample preparation for high-resolution cryoEM analysis involves trapping macromolecules that are evenly distributed in a wide range of orientations within a thin layer of vitrified ice. The &#34;blot and plunge&#34; methods of freezing are the most widely used methods employed to generate thin films of biological samples on grids for cryoEM studies9,10. These methods involve applying a few microliters of sample solution to an EM grid containing a fenestrated film that has been made hydrophilic and subsequently blotting away the majority of the sample with filter paper before rapidly plunging the grid into a cryogen of liquid ethane or ethane-propane mixture9.
While this method has successfully been used to determine structures of a wide range of biological specimens, all commonly used cryoEM specimen preparation methods expose specimens to the hydrophobic air-water interface (AWI), which often introduces&#160;issues that limit high-resolution structure determination. It is established that biological specimens have a high propensity to denature when exposed to the AWI, which can lead to complex aggregation and disassembly11,12,13,14. Furthermore, hydrophobic patches on the surfaces of biological specimens cause particles to adopt preferred orientations in the ice12. In many scenarios, a single hydrophobic region of the sample forces all particles to adopt a singular orientation in the ice, thereby abolishing the ability to generate a reliable reconstruction. In addition to issues with the AWI, specimens may demonstrate an affinity for the surface of the fenestrated layer of film, limiting the number of particles suspended in the ice within the holes15.
Several methodological and technological solutions have been developed to diminish these issues arising from interactions with the AWI or the films16,17. One popular approach is to coat the fenestrated film of the EM grids with a thin (tens of nanometers) layer of amorphous carbon. This coating provides a continuous surface across the holes to which particles can adsorb, with the benefit of partially shielding the sample from interactions with the AWI15,18,19,20. However, the additional carbon layer elevates the amount of background signal in the imaged regions, introducing noise that can compromise attainable resolution, particularly for small (&#60;150 kDa) specimens. In recent years, the use of graphene oxide (GO) flakes to produce supporting films on cryoEM grids has been shown to have advantages over traditional amorphous carbon. GO flakes are produced through the oxidation of graphite layers, resulting in pseudo-crystalline sheets of monolayer graphite that are hydrophilic due to their substantial oxygen content in the form of carboxyl, hydroxyl, and epoxy groups on the surfaces and edges. Commercial GO flakes in aqueous suspensions are inexpensive, and there are numerous published methods for applying GO flakes to EM grids18,21. However, these methods often result in grids that are only partially covered with GO flakes, as well as regions that contain multiple layers of GO flakes. Further, GO flakes contribute a noticeable background signal to cryoEM images that is close to that observed with thin amorphous carbon22,23.
Pristine monolayer graphene, which consists of a single 2D crystalline array of carbon atoms, is distinct from GO in that it does not produce phase contrast in the electron microscope. Monolayer graphene thus can be used to generate an invisible support layer for imaging biological samples. Monolayer graphene is also stronger than GO and can be applied as a single monolayer on an EM grid, and recent advancements in the fabrication of graphene-coated EM grids have made it possible to prepare high-coverage monolayer graphene grids in-house24,25,26,27,28,29,30. However, despite the benefits of using graphene-coated grids for cryoEM structure determination, they are not widely used due to the prohibitive expense of commercial options and the complexity of in-house production. Here, we describe a step-by-step guide to effectively producing EM grids covered with a monolayer of graphene for cryoEM structure determination of biological specimens (Figure 1). By following this detailed protocol, cryoEM researchers can reproducibly prepare dozens of high-quality graphene support grids in a single day. The quality of the graphene-coated grids can be readily examined using a low-end transmission electron microscope (TEM) equipped with a LaB6 filament.

Autor destacado: Mejora de la resolución de CryoEM mediante rejillas recubiertas de grafeno 

Fabricación de rejillas monocapa recubiertas de grafeno para criomicroscopía electrónica

Currently optimally preserving biological samples is a major challenge in obtaining high resolution CryoEM structures. During the sample preparation process, specimens are exposed to hydrophobic air-water interface, which has denaturing effects on the samples and can cause stable samples to adopt a preferential orientation in the ice, which prevents high resolution structure determination. Coating CryoEM grids with a thin layer of carbon of like soft graphene oxide, has been commonly used to address issues related to interactions with air-water interface.However, this layers often increase background noise in our images, which compromise the resolutions of our structure. Coating the grid with a monolayer of graphene accomplishes similar protection without introducing significant background noise. Using graphene-coated CryoEM grids can help overcome issues related to interactions with air-water interface, however, commercial graphene grids are expensive and many labs consider graphene grids to be too complicated to prepare in-house.Researchers in the CryoEM field can now use this step-by-step protocol to reproduce fully produced dozens of high quality graphenes in one day.

La ejecución exitosa del protocolo de fabricación de rejillas de grafeno descrito aquí dará como resultado rejillas EM que están completamente recubiertas con una sola monocapa de grafeno. La cobertura de grafeno de las rejillas se puede comprobar utilizando cualquier TEM. Dado que una monocapa de grafeno limpio es casi invisible en el TEM, se debe examinar utilizando el modo de difracción del microscopio y observar los puntos de Bragg correspondientes a la organización hexagonal de los átomos de carbono que componen el grafeno (Figura 3A). Es normal observar ocasionalmente algunas arrugas de grafeno monocapa, que se introducen durante el recubrimiento de MMA (Figura 3B). También se puede comprobar el nivel de contaminación presente en el grafeno adquiriendo una imagen de gran aumento en el centro de uno de los agujeros cubiertos de grafeno (Figura 3C). Si se adquiere con un detector de alta resolución, una transformada de Fourier de esta imagen debería contener manchas de Bragg correspondientes al espaciamiento carbono-carbono a 2,14 Å (Figura 4C). Una monocapa de átomos de carbono no produce suficiente dispersión de electrones para generar contraste de fase y, por lo tanto, una imagen de grafeno limpio no presentará anillos de Thon asociados con la función de transferencia de contraste en una transformada de Fourier de la imagen. Sin embargo, es muy difícil prevenir la contaminación de las rejillas de grafeno después de su producción, y el lavado insuficiente de las rejillas EM o la eliminación de MMA después del recubrimiento de grafeno darán como resultado contaminantes notables en las rejillas que son visibles en las imágenes del espacio real (Figura 3C). Como se muestra en la Figura 4, las rejillas de grafeno tienen un efecto concentrador en una muestra, como se observa cuando se comparan 0,5 mg/mL de apoferritina aplicada a rejillas de oro agujereadas con (Figura 4A) y sin el soporte de grafeno (Figura 4B). Previamente se han descrito protocolos similares de fabricación de grafeno para resolver estructuras crioEM de proteínas como la apoferritina a alta resolución25,27.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig01.jpg"> Figura 1: Esquema para la preparación de rejillas crioEM recubiertas de grafeno. Se ilustran los pasos clave en el proceso de fabricación de rejillas de grafeno. Abreviaturas: cryoEM = microscopía electrónica criogénica; MMA = metacrilato de metilo; APS = persulfato de amonio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig02.jpg"> Figura 2: Materiales necesarios para la fabricación de rejillas de grafeno . (A) Los materiales necesarios para recubrir las rejillas crio-EM se etiquetan en consecuencia. (B) Vista de primer plano de la recubridora con una lámina de grafeno/Cu pegada con cinta adhesiva en un papel secante en un portaobjetos de vidrio. La máquina de recubrimiento giratorio se puede ensamblar comprando piezas en una tienda local de computadoras/hardware. (C) Vista de cerca del canal de recubrimiento de rejilla conectado a una jeringa que se puede usar para controlar el nivel del agua. Las cuadrículas se colocan encima de un papel secante sobre una malla de acero inoxidable. El papel secante ayuda a maniobrar la ubicación de las cuadrículas para que la hoja de grafeno pueda coincidir con ella. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig03.jpg"> Figura 3: Una imagen representativa del patrón de difracción e imágenes de campo claro de una cuadrícula de grafeno que muestra arrugas o contaminación por MMA . (A) Las rejillas EM cubiertas con una monocapa de grafeno mostrarán picos de Bragg correspondientes a la red hexagonal del grafeno cuando se visualicen en un TEM en modo de difracción. El pico de Bragg correspondiente al espaciado carbono-carbono de 2,14 Å está encerrado en un círculo y se indica con una flecha. (B) Una imagen de campo claro de una cuadrícula de grafeno monocapa con algunas arrugas (marcadas con una flecha) en la monocapa de grafeno. (C) Una imagen de campo claro de grafeno monocapa con contaminación por MMA (indicada con una flecha). Barras de escala = 100 nm (B,C). Abreviaturas: EM = microscopía electrónica; MMA = metacrilato de metilo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig04.jpg"> Figura 4: Apoferritina en rejillas de oro cubiertas de grafeno: (A) Micrografía crioEM de 0,5 mg/ml de apoferritina en rejillas de oro recubiertas de grafeno. (B) La apoferritina obtenida a la misma concentración es visible a una concentración sustancialmente más baja cuando se prepara utilizando rejillas de oro agujereadas sin grafeno. (C) FFT de la micrografía crioEM de 0,5 mg/mL de apoferritina en rejillas de oro recubiertas de grafeno, con los picos de Bragg correspondientes a la red hexagonal de grafeno denotada. Barras de escala = 100 nm (A,B). Abreviaturas: cryoEM = microscopía electrónica criogénica; FFT = transformada rápida de Fourier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Aquí, describimos un protocolo para aplicar una sola monocapa de grafeno a rejillas de microscopía electrónica y cómo prepararlas para su uso en la determinación de la estructura crioEM.

Cryogenic electron microscopy (cryoEM) has emerged as a powerful technique for probing the atomic structure of macromolecular complexes. Sample ...

En la actualidad, la conservación óptima de las muestras biológicas es un reto importante en la obtención de estructuras CryoEM de alta resolución. Durante el proceso de preparación de la muestra, las muestras se exponen a la interfaz hidrofóbica aire-agua, que tiene efectos desnaturalizantes en las muestras y puede hacer que las muestras estables adopten una orientación preferencial en el hielo, lo que impide la determinación de la estructura de alta resolución. El recubrimiento de las rejillas CryoEM con una fina capa de carbono similar al óxido de grafeno blando se ha utilizado comúnmente para abordar problemas relacionados con las interacciones con la interfaz aire-agua.Sin embargo, estas capas a menudo aumentan el ruido de fondo en nuestras imágenes, lo que compromete las resoluciones de nuestra estructura. El recubrimiento de la rejilla con una monocapa de grafeno logra una protección similar sin introducir un ruido de fondo significativo. El uso de rejillas CryoEM recubiertas de grafeno puede ayudar a superar los problemas relacionados con las interacciones con la interfaz aire-agua, sin embargo, las rejillas de grafeno comerciales son costosas y muchos laboratorios consideran que las rejillas de grafeno son demasiado complicadas de preparar internamente.Los investigadores en el campo de CryoEM ahora pueden usar este protocolo paso a paso para reproducir docenas de grafenos de alta calidad completamente producidos en un día.

fabrication-monolayer-graphene-coated-grids-for-cryoelectron

Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy

1.9K vistas.  Scripps Research. En la actualidad, la conservación óptima de las muestras biológicas es un reto importante en la obtención de estructuras CryoEM de alta resolución. Durante el proceso de preparación de la muestra, las muestras se exponen a la interfaz hidrofóbica aire-agua, que tiene efectos desnaturalizantes en las muestras y puede hacer que las muestras estables adopten una orientación preferencial en el hielo, lo que impide la determinación de la estructura de alta resolución. El recubrimiento de...

Video: Autor destacado: Mejora de la resolución de CryoEM mediante rejillas recubiertas de grafeno 

Cryogenic electron microscopy (cryoEM) has emerged as a powerful technique for probing the atomic structure of macromolecular complexes. Sample preparation for cryoEM requires preserving specimens in a thin layer of vitreous ice, typically suspended within the holes of a fenestrated support film. However, all commonly used sample preparation approaches for cryoEM studies expose the specimen to the air-water interface, introducing a strong hydrophobic effect on the specimen that often results in denaturation, aggregation, and complex dissociation. Further, preferred hydrophobic interactions between regions of the specimen and the air-water interface impact the orientations adopted by the macromolecules, resulting in 3D reconstructions with anisotropic directional resolution. 
Adsorption of cryoEM specimens to a monolayer of graphene has been shown to help mitigate interactions with the air-water interface while minimizing the introduction of background noise. Graphene supports also offer the benefit of substantially lowering the required concentration of proteins required for cryoEM imaging. Despite the advantages of these supports, graphene-coated grids are not widely used by the cryoEM community due to the prohibitive expense of commercial options and the challenges associated with large-scale in-house production. This paper describes an efficient method for preparing batches of cryoEM grids that have nearly full coverage of monolayer graphene.

Here, we describe a protocol for applying a single monolayer of graphene to electron microscopy grids and how to prepare them for use in cryoEM structure determination.

Investigación

Biología

Coating Single-Layer Graphene-Copper Sheet with MMA and Cleaning the Grids

To begin, inside a fume hood, place a cover slip with the taped graphene sheet on a homemade spin coater. Wearing safety goggles, use a glass pipette to add two drops of methyl methacrylate, or MMA, onto the graphene sheet, and immediately start spinning at maximum speed. While spinning, add two more drops in the center and spin for one minute.After cleaning and drying three crystallizing dishes, pour 200 milliliters of chloroform, acetone, and isopropyl alcohol into each dish. Place the base of the clamping TEM grid holder block at the bottom of the first dish containing 200 milliliters of chloroform. Ensuring the fenestrated film side is facing up, transfer each grid individually from the grid box to a well in the grid holder block.Cover the dish with aluminum foil and place it on an orbital shaker to gently shake for 30 minutes. Next, place the metal lid on the grid holder block to secure the grids for transfer to the next crystallizing dish. Using a bent fork and a long tweezer, carefully lift the grid holder block out of the dish and place it at the bottom of the second dish containing 200 milliliters of acetone.Remove the lid from the grid holder block and gently shake it on an orbital shaker. After 30 minutes, place the lid on the grid holder block and transfer it to a dish containing 200 milliliters of isopropyl alcohol to remove acetone residue. Remove the lid from the grid holder block and gently shake it for 20 minutes.Individually transfer the grids with the fenestrated film side up from the grid holder block to a glass Petri dish covered with blotting paper.

Recubrimiento de lámina de grafeno-cobre de una sola capa con MMA y limpieza de las rejillas

Transferring Grids to a Perforated Tray Under DI Water, Transferring Graphene to the Grids, Removing MMA, and Cleaning the Grids

Transfer the cleaned grids with the fenestrated film side facing up onto the wet blotting paper. Submerge the hydrophobic grids vertically into the water to prevent bending due to water tension. Arrange the submerged grids in a square array, keeping them close but not overlapping.Fill the grid coating trough with more deionized water, ensuring the water surface is at least five millimeters above the grids. To scoop out the MMA graphene film from the dish, slowly lower the cover slip into the dish at an angle, some distance away from the graphene film. Position the cover slip underneath the graphene MMA sheet and align its edges parallelly with the sheet.Then, lift the cover slip vertically from the water, bringing the MMA graphene film with it. Transfer the MMA graphene film to the trough by lowering the cover slip into the water at a 45-degree angle so that the film detaches from the cover slip and floats on the water surface. Position the MMA graphene film above the grids before the water level decreases.Using a Pasteur pipette whose tip has been melted closed, carefully manipulate the MMA graphene film's position. Using a syringe, slowly lower the water level such that the MMA graphene film perfectly lands on the grids and completely covers their surfaces. Using a pair of clean, dry tweezers, lift the blotting paper holding the grids to a clean, dust-free Petri dish.Place the base of the clamping TEM grid holder block at the bottom of the first crystallizing dish containing 200 milliliters of fresh acetone. Individually, transfer each grid with the MMA side facing up from the blotting paper to a well in the grid holder block. Cover the dish with foil, and gently shake on an orbital shaker for 30 minutes.Secure the grids by placing the metal lid on the grid holder block. Then, using a bent fork or long tweezers, carefully lift the block out of the dish and place it at the bottom of the second dish containing 200 milliliters of fresh acetone. After removing the lid from the block, gently shake it on an orbital shaker for 30 minutes.Place the lid back on the grid holder block and transfer it to the dish containing 200 milliliters of isopropyl alcohol. Remove the lid before gently shaking for 20 minutes. Transfer the grids to a small glass Petri dish covered with blotting paper and air dry the grids for 10 minutes.In TEM diffraction modes, EM grids covered with a monolayer of graphene show Bragg peaks corresponding to the hexagonal lattice of the graphene. Graphene grids have a concentrating effect on a sample as observed when comparing apoferritin applied to holy gold grids with and without the graphene support. A fast Fourier transform of the cryoEM micrograph of apoferritin on graphene-covered gold grids also showed Bragg peaks corresponding to the hexagonal graphene lattice.

Transferencia de rejillas a una bandeja perforada bajo agua desionizada, transferencia de grafeno a las rejillas, eliminación de MMA y limpieza de las rejillas