Os autores gostariam de agradecer a Farhad Farjood pela ajuda com a cultura e isolamento de células de EPR suíno e a Thomas Harris pela ajuda com MEV. Os autores agradecem o apoio do Microscopy Core Facility da Utah State University para a análise de MEV. A instalação mantém um microscópio eletrônico de varredura adquirido através de uma National Science Foundation Major Research Instrumentation Grant (CMMI-1337932). O financiamento para este estudo foi fornecido por um National Institutes of Health através do Grant 1R15EY028732 (Vargis) e um BrightFocus Foundation Grant M2019109 (Vargis). O financiamento adicional foi fornecido por uma Bolsa de Pesquisa de Graduação e Oportunidades Criativas (Weatherston) do Escritório de Pesquisa da Universidade Estadual de Utah e uma bolsa de sementes (Vargis) do Centro de Pesquisa de Doença de Alzheimer e Demência da Universidade Estadual de Utah.

Os olhos usados neste procedimento são obtidos post-mortem de um açougue local, inspecionado pelo USDA, e nenhum trabalho é realizado usando animais vivos. Após o sacrifício dos animais, passam aproximadamente 2 h antes que os olhos sejam enucleados. Como a deterioração do tecido pode começar a ocorrer, é importante manter os olhos frescos durante o transporte para evitar mais decaimento. Neste procedimento, os olhos são imediatamente colocados em uma geladeira após a enucleação. Em seguida, a bolsa dos olhos é posicionada dentro de um copo de polipropileno de 1000 mL e cercada por gelo dentro de um resfriador de 8 L. É importante não colocar os olhos diretamente no gelo. Assim que os olhos chegam ao laboratório, o isolamento das células de EPR é realizado dentro de um gabinete de biossegurança. É crucial concluir este processo dentro de 3-5 h. Este protocolo foi otimizado para o processamento de 10 olhos.
1. Preparação das alíquotas de estoque da DNase
Observação : é recomendável que essa etapa seja executada antes do isolamento.
<ol><li>Preparar uma solução de cloreto de cálcio 5 mM com água deionizada estéril. CUIDADO: O cloreto de cálcio em pó pode causar irritação ou danos oculares graves. Use EPIs apropriados.</li>
	<li>Adicionar 5 mM de solução de cloreto de cálcio ao pó de DNase (ver Tabela de Materiais) para obter uma concentração final de DNase de 3 mg/ml. Certifique-se de que a solução está bem misturada. CUIDADO: DNase é um risco de sensibilização respiratória. Não inalar pó/substância.</li>
	<li>Alíquota pequenos volumes, por exemplo 1 mL, em tubos de microcentrífuga.</li>
	<li>Congelar alíquotas a -20 °C até à utilização.</li>
</ol>2. Configuração da área de dissecção
<ol><li>Transfira os instrumentos de dissecção estéreis e o equipamento de cultura celular para o gabinete de biossegurança: cortina cirúrgica, placas de Petri, filtros de células, placas de poço, gaze, pinça, cabo de bisturi, lâmina de bisturi e tesoura de íris (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Usando uma pinça, coloque o campo cirúrgico. Coloque uma placa de 6 poços sobre o pano cirúrgico e remova a tampa.</li>
	<li>Coloque uma alíquota de Fosfato Buffered Saline (DPBS) estéril de Dulbecco no gelo e no armário de biossegurança.</li>
	<li>Encher um poço de uma placa de 6 poços meio cheia (aproximadamente 6 mL) de solução de iodopovidona a 10%.</li>
	<li>Encha os poços restantes com DPBS refrigerados.</li>
	<li>Retire a tampa de uma das placas de Petri e coloque-a, invertida, sobre o campo cirúrgico. Separe a base da placa de Petri como recipiente de resíduos.</li>
	<li>Coloque uma alíquota de meio de cultura celular (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 1% antibióticos/antimicóticos) e uma alíquota de 0,25% de tripsina/EDTA em banho-maria a 37 °C.</li>
	<li>Remova a solução-mãe DNase do congelador (consulte o resto do protocolo para obter mais detalhes).</li>
</ol>3. Remoção de tecido exterior
NOTA: A remoção de tecido exterior pode ser realizada fora do gabinete de biossegurança. Inspecione o olho antes do corte para garantir que a esclera não foi perfurada, a pupila não está embaçada e o nervo óptico está presente. Descarte os olhos que não atendem a esses critérios.
<ol><li>Ao segurar o músculo preso ao olho com uma mão, use a outra mão para cortar suavemente o tecido ao redor da esclera com um bisturi. Tenha cuidado para não esmagar o olho ou cortar acidentalmente a esclera. Se a esclera for cortada e expor o interior preto, descarte o olho. CUIDADO: Uma luva resistente ao corte é altamente recomendada para a mão que segura o músculo para proteger contra cortes acidentais.</li>
	<li>Corte o nervo óptico com uma tesoura de íris curva até um comprimento não superior a 3 mm. Se o nervo óptico for muito longo, o copo ocular não ficará adequadamente no filtro de células mais tarde.</li>
	<li>Coloque o olho no gelo com a córnea para baixo.</li>
	<li>Repita os passos 3.1-3.3 até que o tecido exterior seja removido de cada olho.</li>
</ol>4. Dissecção ocular
<ol><li>Use uma pinça para transferir um olho para o armário de biossegurança e para o poço contendo solução de iodopovidona a 10% e gire o olho para garantir que ele seja totalmente revestido na solução de iodo. Para manter as ferramentas o mais estéreis possível, essas pinças devem ser usadas apenas para tocar o exterior do olho.</li>
	<li>Enquanto o olho estiver sentado em solução de iodo, coloque uma gaze estéril sobre a pálpebra rasa e invertida da placa de Petri preparada anteriormente. Em uma placa de Petri separada, coloque um filtro de células. Use apenas o filtro de células para apoiar o copo dos olhos, não para a separação celular.</li>
	<li>Depois de permitir que o olho se sente em solução de iodo por aproximadamente 30 s, lave o olho mergulhando-o nos poços contendo DPBS por aproximadamente 5 s cada, movendo-se de poço em poço para diluir progressivamente a solução de iodo e transferir o olho para a gaze estéril.</li>
	<li>Faça uma pequena incisão usando um bisturi abaixo da ora serrata, ou aproximadamente 1/3 abaixo do globo a partir da borda da íris.</li>
	<li>Após a incisão, use tesoura de íris para cortar uniformemente ao longo da circunferência do globo, paralelo à córnea. Ao manobrar o olho, use apenas a pinça para tocar a parte externa do olho ou a gaze para manter a esterilidade.</li>
	<li>Use a pinça para agarrar o nervo óptico e levantar suavemente o globo para longe da gaze. O vítreo deve cair para fora do globo. Se necessário, agite suavemente o olho para ajudar a desalojar o vítreo. NOTA: Se o vítreo for muito difícil de remover, tente cortar mais baixo no globo.</li>
	<li>Coloque suavemente o copo dos olhos no filtro de células preparado, com o interior do copo dos olhos virado para cima. Se estiver irregular, use uma pinça para ajustar o copo ocular para que a incisão fique o mais nivelada possível.</li>
	<li>Adicione suavemente DPBS resfriado ao copo dos olhos para que o nível de líquido fique logo abaixo do ponto mais baixo da incisão. Esta DPBS será removida após a remoção da retina neural. NOTA: O volume de DPBS adicionado irá variar dependendo do tamanho do olho e da localização da incisão.</li>
	<li>Repita os passos 4.1-4.8 até que todos os olhos estejam dissecados.</li>
</ol>5. Remoção da retina neural e dissociação do EPR
Observação : a seção a seguir é mais fácil de executar em estágios. Nesta configuração, este processo é realizado em um lote (geralmente 3 copos de olhos) de cada vez. Para as etapas 5.1-5.7, cada etapa deve ser executada em todo o lote antes de passar para a próxima etapa.
<ol><li>Sob uma lanterna, encontre as áreas onde a retina neural (branca/rosa) está começando a se desprender do EPR (preto). Em seguida, use uma pinça romba para agarrar suavemente a retina neural levantada e descascá-la. NOTA: Se não houver áreas onde a retina neural está se desprendendo, use a pinça para agarrá-la suavemente perto da parte superior do copo dos olhos. Usando este método, se houver dano ao EPR/coroide, essas células não serão dissociadas durante a coleta do EPR.</li>
	<li>Colete suavemente a retina neural perto do disco óptico.</li>
	<li>Aspirar a retina neural usando uma pipeta de Pasteur conectada a um sistema de aspiração a vácuo. Recomenda-se penar a aspiração para ajudar no processo de remoção. NOTA: Uma ponta de pipeta pode ser colocada na extremidade de uma pipeta Pasteur para reduzir a sucção.</li>
	<li>Adicione cuidadosamente DPBS resfriados adicionais para substituir o que foi aspirado.</li>
	<li>Remova a retina neural remanescente aspirando novamente. Desta vez, remova o máximo de DPBS possível, sem perturbar o EPR exposto.</li>
	<li>Adicione suavemente tripsina ao copo dos olhos. Mantenha o nível de volume abaixo da linha de incisão e quaisquer seções de EPR danificadas para reduzir a contaminação. CUIDADO: A tripsina é uma enzima que causará irritação na pele e nos olhos ao contato. Use EPIs apropriados.</li>
	<li>Depois que a tripsina for adicionada a cada olho, certifique-se de que a tampa da placa de Petri seja substituída. Em seguida, transferir a placa de Petri para uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% CO2 por 30 min.</li>
	<li>Repita as etapas 5.1-5.7 para cada lote até que todos os óculos tenham sido processados.</li>
</ol>6. Coleta de EPR
<ol><li>Coletar as células de EPR de cada lote de olhos (2-3 olhos) e colocar em um único tubo de centrífuga de 15 mL para tornar o processo de semeadura simples.<ol><li>Sob uma lanterna, triture suavemente usando uma pipeta de 1000 μL para desalojar as células de EPR. Se as células do EPR não estiverem se destacando, adicione tripsina fresca e incube por mais 10-15 min. Tenha cuidado para não raspar a retina.</li>
		<li>Coletar as células de EPR em um tubo de centrífuga de 15 mL.</li>
		<li>Lave o copo ocular com meios de cultura celular para coletar as células restantes e neutralizar a tripsina. Certifique-se de que há pelo menos o dobro do volume de meio para tripsina no tubo de centrífuga de 15 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Repetir o passo 6.1 até que as células do EPR tenham sido recolhidas de todos os óculos.</li>
	<li>Centrifugar as suspensões celulares a 250 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente.</li>
</ol>7. Preparação da solução de trabalho DNase
<ol><li>Calcular o volume de 3 mg/mL de solução-mãe de DNase (preparada na etapa 1) necessária para adicionar ao meio de cultura celular para uma concentração final de 100 μg/mL e volume final de 3 mL por tubo de células (ou seja, para três tubos de centrífuga de células, são necessários 9 mL de solução de DNase a 100 μg/mL).</li>
	<li>Combinar os volumes apropriados de solução-mãe de DNase e meios de cultura celular. O uso de DNase na solução de trabalho ajuda a prevenir a aglomeração celular e permite que as células sejam semeadas uniformemente.</li>
</ol>8. Semeadura de células RPE
<ol><li>Após a centrifugação na etapa 6.3, remova os sobrenadantes de cada tubo de centrífuga de 15 mL, com cuidado para não interromper o pellet celular.</li>
	<li>Ressuspender cada pellet de célula em 3 mL de solução de trabalho DNase.</li>
	<li>Colocar os tubos de centrífuga de 15 mL contendo as células ressuspensas em uma estufa umidificada a 37 °C e 5% CO2 por 15 min.</li>
	<li>Após a incubação, centrifugar as suspensões celulares a 150 x g por 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Remova os sobrenadantes, com cuidado para não atrapalhar os pellets celulares.</li>
	<li>Ressuspender cada pastilha celular em 3 mL de meio de cultura de células frescas.</li>
	<li>Para cada tubo de centrífuga contendo 2-3 olhos de células de EPR, semeie um poço de uma placa de 6 poços (passagem 0).</li>
	<li>Cuidadosamente, transfira a placa de 6 poços semeada para uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% CO2.</li>
</ol>9. Cultivo primário de células de EPR suíno
<ol><li>Deixe as células de EPR recém-semeadas se fixarem por 48-72 h antes de mover a placa. Durante a primeira troca de meio, uma lavagem com meios de cultura de células frescos pode ser realizada para ajudar a remover o excesso de detritos celulares.</li>
	<li>Substitua o meio de cultura celular a cada 48 h.</li>
	<li>Quando as células atingem a confluência, faça a transição para um meio de cultura celular com uma concentração de FBS de 2% e mantenha até a experimentação.</li>
</ol>10. Validação da célula RPE
<ol><li>Coloração imunocitoquímica (ICC)<ol><li>Fixar as células em formaldeído a 4% em DPBS por 10 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Lave duas vezes com DPBS.</li>
		<li>Permeabilizar as células (se necessário) usando Triton-X 100 a 0,2% em DPBS por 10 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Lave duas vezes com DPBS.</li>
		<li>Aplicar solução de bloqueio de albumina de soro bovino (BSA) a 3% (p/v) em DPBS durante 1 h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Adicionar o anticorpo primário à diluição de 1:100 (ou concentração recomendada do fabricante) (ver Tabela de Materiais) e deixar descansar durante 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.</li>
		<li>Lave três vezes com DPBS por 5 min cada.</li>
		<li>Adicione o anticorpo secundário (se necessário) a 2 μg/mL (ou concentração recomendada do fabricante) (ver Tabela de Materiais) e deixe descansar por 1 h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavar três vezes com DPBS durante 5 minutos cada se for aplicado anticorpo secundário.</li>
		<li>Adicione a sonda de coloração nuclear na concentração do fabricante (ver Tabela de Materiais) e deixe descansar por 25 minutos à temperatura ambiente.</li>
		<li>Lave três vezes com PBS por 5 min cada.</li>
		<li>Se em uma cultura de células inserir, montar na lâmina do microscópio com uma lamínula usando meio de montagem como descrito por Rickabaugh e Weatherston et al.20. Caso contrário, células de imagem no DPBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopia eletrônica de varredura (MEV)<ol><li>Siga o procedimento descrito por Harris et al.21.</li>
	</ol></li>
	<li>Resistência Elétrica Trans Epitelial (TEER)<ol><li>Seguir o protocolo do fabricante para medição TEER (ver Tabela de Materiais) com 1 mL de meio de cultura na câmara basal15.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaio imunoenzimático (ELISA)<ol><li>Realizar o ELISA15 usando um kit de ensaio imunoenzimático humano multiplex seguindo o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	</ol></li>
</ol>

Um método econômico para isolar células primárias de EPR de olhos suínos

<ol>
	<li>Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+nature+of+Bruch's+membrane.">The dynamic nature of Bruch's membrane.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (1), 1-18 (2010).</li><li>Caceres, P. 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Este protocolo descreve como isolar células de EPR de olhos suínos. A pigmentação e a morfologia dos paralelepípedos são observadas em até 7 dias após o isolamento (Figura 1B). Além disso, os dados TEER indicam a formação de tight junction22 e uma monocamada saudável (Figura 5). Esses resultados mostram que as células do EPR isoladas com este método são semelhantes ao EPR humano e podem ser benéficas em modelos de cultura ...

O epitélio pigmentado da retina (EPR) é uma monocamada localizada na retina externa entre a membrana de Bruch e os fotorreceptores1. As células do EPR formam tight junctions com proteínas como a zonula occludens-1 (ZO-1) e possuem um fenótipo distinto, caracterizado por pigmentação e morfologiahexagonal2,3. Essas células contribuem para a barreira hematorretiniana, apoiando a saúde dos fotorreceptores e mantendo a homeostase retiniana 4,5. Além disso, as células do EPR desempenham um papel crítico na visão, absorvendo luz e reciclando componentes essenciais para os fotorreceptores6. Por exemplo, a RPE65, uma proteína altamente expressa em células de EPR, converte ésteres de retinila trans-trans em retinol 11-cis 7,8. Dada a multiplicidade de funções desempenhadas pelas células do EPR, sua disfunção está implicada em várias doenças, incluindo degeneração macular relacionada à idade e retinopatia diabética 9,10. Para melhorar a compreensão das patologias retinianas e desenvolver novos tratamentos, modelos in vitro da retina são frequentemente empregados.
Para gerar modelos representativos de retinas saudáveis ou doentes, é imperativo usar um tipo de célula RPE mimética. A linhagem celular ARPE-19 comercialmente disponível não possui fenótipos nativos, como pigmentação, enquanto as iPSCs podem levar meses para se diferenciar11,12,13. Embora os olhos de doadores humanos possam ser ideais, eles muitas vezes não estão prontamente disponíveis para muitos laboratórios de pesquisa.
Aqui, desenvolvemos um método para utilizar olhos suínos, que compartilham muitas semelhanças com olhos humanos14, para a obtenção de células primárias do EPR. Essas células primárias do EPR suíno têm sido utilizadas em múltiplos modelos de retina15,16. Essas células não são apenas custo-efetivas, mas também requerem menos tempo para serem adquiridas do que as iPSCs ou os olhos de doadores. Além disso, apresentam características nativas, como pigmentação e microvilosidades. Embora existam protocolos semelhantes para extração de EPR suíno 17,18,19, essa técnica simples e detalhada valida ainda mais a dissociação enzimática e emprega materiais comumente encontrados na maioria dos laboratórios de cultura celular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-14-1-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride, Dried, Powder, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L13191.30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td>one per eye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes, 15 mL</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler, 8 L</td>
			<td>Igloo</td>
			<td>32529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>07-200-154</td>
			<td>Culture inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut Resistant Glove</td>
			<td>Dowellife</td>
			<td>712971375857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytiva&#160;HyClone Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline, Solution</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SH3026401</td>
			<td>for ICC dilutions only&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine &#38; sodium pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I from Bovine Pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS/Modified - calcium - magnesium</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH3002B.02</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex)&#160;</td>
			<td>Quansys Biosciences, Logan, UT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ENDOHM 6 TEER device</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>232B20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents&#160;Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP9706100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flashlight</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>LC146501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Sponges</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22-415-504</td>
			<td>One per eye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32728</td>
			<td>RPE65 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Crushed prefered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen&#160;NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5&#34;</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-10818-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-822-379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM-710 Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, 100 mm x 20 mm&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td>one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-Iondine Solution, 10%</td>
			<td>Equate</td>
			<td>49035-050-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA116578</td>
			<td>RPE65 primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades Size 10</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>22-079-683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handles Style 3</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-118-4164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Drape, 18 x 26&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-209-1792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>37 &#176;C, 5% CO2, 95% Humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plates, 6 Wells</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>One for eye wash and one for seeding&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-955-111F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#160;X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25053Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Style 20A</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>17-467-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Style 2A</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-238-47</td>
			<td>for removing neural retina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Style 5-SA-PI</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>17-467-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Aspiration System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath, 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>33-911-1</td>
			<td>ZO-1 conjugated primary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary porcine retinal pigment epithelial cells for in vitro modeling

O epitélio pigmentado da retina (EPR) é uma monocamada crucial na retina externa responsável pela sustentação dos fotorreceptores. A degeneração do EPR ocorre comumente em doenças marcadas pela perda progressiva da visão, como a degeneração macular relacionada à idade (DMRI). A pesquisa sobre DMRI geralmente se baseia em olhos de doadores humanos ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) para representar o EPR. No entanto, essas fontes de EPR requerem longos períodos de diferenciação e conhecimentos substanciais para o cultivo. Além disso, algumas instituições de pesquisa, particularmente aquelas em áreas rurais, não têm fácil acesso aos olhos dos doadores. Embora exista uma linhagem celular de EPR imortalizada comercialmente disponível (ARPE-19), ela carece de características essenciais de EPR in vivo e não é amplamente aceita em muitas publicações de pesquisa em oftalmologia. Há uma necessidade premente de obter células primárias representativas do EPR a partir de uma fonte mais prontamente disponível e econômica. Este protocolo elucida o isolamento e subcultivo de células primárias de EPR obtidas post-mortem de olhos suínos, que podem ser obtidas localmente de fornecedores comerciais ou acadêmicos. Este protocolo necessita de materiais comuns tipicamente encontrados em laboratórios de cultura de tecidos. O resultado é uma alternativa primária, diferenciada e custo-efetiva para iPSCs, olhos de doadores humanos e células ARPE-19.

Usando este procedimento, células primárias do EPR foram isoladas com sucesso de olhos suínos. A Figura 1A mostra as células do EPR 3 dias após o isolamento com pigmentação característica. Após 1 semana de crescimento, as células estavam totalmente confluentes e formavam uma monocamada saudável (Figura 1B). As células foram então transferidas para pastilhas de cultura celular, onde mantiveram sua pigmentação e morfologia (Figu...

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Autor em destaque: Modelando patologias da retina com modelos aprimorados de doenças baseadas em células RPE

Este protocolo descreve o procedimento para obtenção e cultivo de células epiteliais pigmentares primárias da retina (EPR) a partir de olhos suínos de origem local. Essas células servem como uma alternativa de alta qualidade às células-tronco e são adequadas para pesquisas in vitro da retina.

Isolamento de células epiteliais pigmentares primárias da retina suína para modelagem in vitro

The retinal pigment epithelium (RPE) is a crucial monolayer in the outer retina responsible for supporting photoreceptors. RPE degeneration commonly ...

Projetamos modelos de doenças para mimetizar aspectos de patologias retinianas. Com esses modelos, podemos entender melhor o papel das células do EPR em doenças com base em sua resposta a mudanças físicas, como quando ocorre uma deformação na monocamada ou uma membrana brex engrossa com a idade. Um dos maiores desafios é ter um tipo de célula representativa.Em comparação com a linhagem celular imortalizada comumente usada, as células primárias isoladas com essa técnica tornam nossos modelos de doença mais realistas ao que acontece em nossos olhos. Esta técnica nos fornece um método de obtenção de células de alta qualidade sem a necessidade de extensos tempos de diferenciação. Além disso, utilizamos recursos que são comumente disponíveis para os laboratórios de pesquisa, o que o torna mais econômico.Seguindo em frente, queremos ver como as mudanças naturais que acontecem em seus olhos durante o envelhecimento, podem levar aos estágios iniciais da DMRI. Queremos entender melhor essas mudanças para que possamos identificar alvos específicos de tratamento.

isolation-primary-porcine-retinal-pigment-epithelial-cells-for-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Primary Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells for In Vitro Modeling

729 visualizações.  Utah State University. Projetamos modelos de doenças para mimetizar aspectos de patologias retinianas. Com esses modelos, podemos entender melhor o papel das células do EPR em doenças com base em sua resposta a mudanças físicas, como quando ocorre uma deformação na monocamada ou uma membrana brex engrossa com a idade. Um dos maiores desafios é ter um tipo de célula representativa.Em comparação com a linhagem celular imortalizada comumente usada, as células primárias isoladas com essa técnica to...

Vídeo: Autor em destaque: Modelando patologias da retina com modelos aprimorados de doenças baseadas em células RPE

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Isolamento de cromatina por purificação de RNA (CHIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Biologia

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

Perfis de expressão de microRNA iPS Human Cells, Retinal Pigment Epithelium Derivado de Ips, e Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

Culturas de células primárias do Mouse epithelium Retinal do Pigment

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a multifactorial disease influenced by environmental and genetic factors, which lead to functional impairment of the retina due to retinal pigment epithelial (RPE) cell degeneration followed by photoreceptor degradation. An ideal treatment would include the transplantation of healthy RPE cells secreting neuroprotective factors to prevent RPE cell death and photoreceptor degeneration. Due to the functional and genetic similarities and the possibility of a less invasive biopsy, the transplantation of iris pigment epithelial (IPE) cells was proposed as a substitute for the degenerated RPE. Secretion of neuroprotective factors by a low number of subretinally-transplanted cells can be achieved by Sleeping Beauty (SB100X) transposon-mediated transfection with genes coding for the pigment epithelium-derived factor (PEDF) and/or the granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF). We established the isolation, culture, and SB100X-mediated transfection of RPE and IPE cells from various species including rodents, pigs, and cattle. Globes are explanted and the cornea and lens are removed to access the iris and the retina. Using a custom-made spatula, IPE cells are removed from the isolated iris. To harvest RPE cells, a trypsin incubation may be required, depending on the species. Then, using RPE-customized spatula, cells are suspended in medium. After seeding, cells are monitored twice per week and, after reaching confluence, transfected by electroporation. Gene integration, expression, protein secretion, and function were confirmed by qPCR, WB, ELISA, immunofluorescence, and functional assays. Depending on the species, 30,000-5 million (RPE) and 10,000-1.5 million (IPE) cells can be isolated per eye. Genetically modified cells show significant PEDF/GM-CSF overexpression with the capacity to reduce oxidative stress and offers a flexible system for ex vivo&#160;analyses and in vivo studies transferable to humans to develop ocular gene therapy approaches.

Here, a protocol to isolate and transfect primary iris and retinal pigment epithelial cells from various mammals (mice, rat, rabbit, pig, and bovine) is presented. The method is ideally suited to study ocular gene therapy approaches in various set-ups for ex vivo&#160;analyses and&#160;in vivo studies transferable to humans.

Isolamento, Cultura e Engenharia Genética de Células Epiteliais de Pigmento Primário mamífero para terapia genética não viral

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Dissecção eficiente e cultura de células epiteliais de pigmento de retina do rato primário

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve causes aortic stenosis and contributes to heart failure and stroke. Disease pathogenesis is multifactorial, and stresses such as inflammation, extracellular matrix remodeling, turbulent flow, and mechanical stress and strain contribute to the osteogenic differentiation of valve endothelial and valve interstitial cells. However, the precise initiating factors that drive the osteogenic transition of a healthy cell into a calcifying cell are not fully defined. Further, the only current therapy for CAVD-induced aortic stenosis is aortic valve replacement, whereby the native valve is removed (surgical aortic valve replacement, SAVR) or a fully collapsible replacement valve is inserted via a catheter (transcatheter aortic valve replacement, TAVR). These surgical procedures come at a high cost and with serious risks; thus, identifying novel therapeutic targets for drug discovery is imperative. To that end, the present study develops a workflow where surgically removed tissues from patients and donor cadaver tissues are used to create patient-specific primary lines of valvular cells for in vitro disease modeling. This protocol introduces the utilization of a cold storage solution, commonly utilized in organ transplant, to reduce the damage caused by the often-lengthy procurement time between tissue excision and laboratory processing with the benefit of greatly stabilizing cells of the excised tissue. The results of the present study demonstrate that isolated valve cells retain their proliferative capacity and endothelial and interstitial phenotypes in culture upwards of several days after valve removal from the donor. Using these materials allows for the collection of control and CAVD cells, from which both control and disease cell lines are established.

This protocol describes the collection of human aortic valves extracted during surgical aortic valve replacement procedures or from cadaveric tissue, and the subsequent isolation, expansion, and characterization of patient specific primary valve endothelial and interstitial cells. Included are important details regarding the processes needed to ensure cell viability and phenotype specificity.

Isolamento de Células Valvares Primárias Humanas para Modelagem de Doenças In Vitro

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

Cultura Primária de Células Epiteliais do Pigmento da Retina Suína

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical roles in maintaining the photoreceptors' function. Thus, the RPE structure and function are essential to sustain normal vision. This manuscript presents an established protocol for primary mouse RPE cell isolation. RPE isolation is a great tool to investigate the molecular mechanisms underlying RPE pathology in the different mouse models of ocular disorders. Furthermore, RPE isolation can help in comparing primary mouse RPE cells isolated from wild-type and genetically modified mice, as well as testing drugs that can accelerate the development of therapy for visual disorders. The manuscript presents a step-by-step RPE isolation protocol; the entire procedure, from enucleation to seeding, takes approximately 4 hours. The media shouldn't be changed for 5-7 days after seeding, to allow the growth of the isolated cells without disturbance. This process is followed by the characterization of morphology, pigmentation, and specific markers in the cells via immunofluorescence. Cells can be passaged a maximum of three or four times.

This manuscript describes a simplified protocol for the isolation of retinal pigmented epithelium (RPE) cells from mouse eyes in a stepwise manner. The protocol includes the enucleation and dissection of mouse eyes, followed by the isolation, seeding, and culturing of RPE cells.

Isolamento das células epitélio pigmentadas do rato primário

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) and proliferative vitreoretinopathy (PVR). Since RPE are highly metabolically-active cells, alterations in their metabolic status reflect changes in their health and function. High-resolution respirometry allows for real-time kinetic analysis of the two major bioenergetic pathways, glycolysis and mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS), through quantification of the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), respectively. The following is an optimized protocol for conducting high-resolution respirometry on primary human retinal pigment epithelial cells (H-RPE). This protocol provides a detailed description of the steps involved in producing bioenergetic profiles of RPE to define their basal and maximal OXPHOS and glycolytic capacities. Exposing H-RPE to different drug injections targeting the mitochondrial and glycolytic machinery results in defined bioenergetic profiles, from which key metabolic parameters can be calculated. This protocol highlights the enhanced response of BAM15 as an uncoupling agent compared to carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) to induce the maximal respiration capacity in RPE. This protocol can be utilized to study the bioenergetic status of RPE under different disease conditions and test the efficacy of novel drugs in restoring the basal metabolic status of RPE.

The metabolic status of human retinal pigment epithelial cells (H-RPE) reflects their health and function. Presented here is an optimized protocol for examining the real-time metabolic flux of H-RPE using high-resolution respirometry.

Análise em Tempo Real da Bioenergética em Células Epiteliais Pigmentares Pigmentares Humanas Primárias Usando Respirometria de Alta Resolução

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration ...

Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential application in molecular biology studies, including gene expression analyses. In the context of eye growth regulation and myopia, the RPE likely plays a role as a cellular relay for growth modulatory signals, as it is located between the retina and the two walls of the eye, such as the choroid and sclera. While protocols for isolating the RPE have been developed for both chicks and mice, these protocols have proven not to be directly translatable to the guinea pig, which has become an important and widely used mammalian myopia model. In this study, molecular biology tools were used to examine the expression of specific genes to confirm that the samples were free of contamination from the adjacent tissues. The value of this protocol has already been demonstrated in an RNA-Seq study of RPE from young pigmented guinea pigs exposed to myopia-inducing optical defocus. Beyond eye growth regulation, this protocol has other potential applications in studies of retinal diseases, including myopic maculopathy, one of the leading causes of blindness in myopes, in which the RPE has been implicated. The main advantage of this technique is that it is relatively simple and&#160;once perfected, yields high-quality RPE samples suitable for molecular biology studies, including RNA analysis.

We describe a simple and efficient method for isolating cells of the retinal pigment epithelium (RPE) cells from the eyes of young pigmented guinea pigs. This procedure allows for follow-up molecular biology studies on the isolated RPE, including gene expression analyses.