El epitelio pigmentario de la retina o EPR es fundamental para la salud de la retina. Y estudiar el EPR aislado es crucial para la enfermedad de la retina. Este método de aislamiento del EPR del conejillo de indias, un modelo popular de miopía, ayuda a resolver el problema desafiante.
La principal ventaja de esta técnica es que es relativamente simple y produce una muestra de EPR de alta calidad adecuada para los estudios moleculares biológicos, incluido el análisis de EPR. Al seguir perfectamente la técnica demostrada y observar cómo manipular las herramientas de disección, uno puede dominar este procedimiento rápidamente con algo de práctica. Después de sacrificar humanamente al conejillo de indias y enuclear los ojos del animal, lávelos inmediatamente transfiriéndolos a una placa de Petri de 10 centímetros que contenga solución salina tamponada con fosfato estéril o PBS.
Después del lavado, transfiera los ojos a una solución fresca de PBS. Ahora trabajando bajo un microscopio de disección, use una aguja de calibre 18 para hacer una pequeña abertura inicial en la esclerótica de un ojo, aproximadamente un milímetro detrás del límite limbal entre la córnea y la esclerótica. Con unas tijeras, retire el segmento anterior, incluyendo la córnea, el iris, el cuerpo ciliar y el cristalino.
Luego, trabajando con un segmento ocular posterior restante, use fórceps para agarrar y tirar suavemente de la zonula de Zinn, seguido de separar la retina del complejo RPE / coroides / esclerótica y pelar la retina sin fragmentación. Después de que la retina se haya extirpado por completo, sumerja la copa ocular posterior restante, que incluye el EPR, la coroides y la esclerótica en uno de los pocillos de una placa de 12 pocillos que contiene dos mililitros de reactivo de almacenamiento de tejido y manténgala sumergida durante cinco minutos. Para enjuagar el reactivo de almacenamiento, transfiera el ocular a otro pozo lleno de cuatro mililitros de PBS durante 10 segundos antes de moverlo a un tercer pozo lleno con dos mililitros de PBS.
Antes de continuar con el paso final de aislamiento del EPR, prepare una jeringa de un mililitro llena de PBS y coloque una aguja de calibre 30. Empuje suavemente el émbolo de la jeringa para crear una corriente de chorro de PBS. Trabajando bajo un microscopio, primero, apunte esta corriente de PBS al RPE para hacer un pequeño desgarro o agujero en él.
Luego dirija la corriente de PBS a la abertura creada para separar el RPE como una hoja de la coroides. Después de separar el EPR de la coroides, recoja las células del EPR en una jeringa sin aguja de un mililitro y transfiera la muestra recolectada a un tubo de 1,5 mililitros. Centrifugar el tubo con el RPE recogido a 8, 000 x g durante un minuto para obtener un pellet de RPE.
Para las muestras que se utilizarán en análisis de ARN, deseche el sobrenadante, que es la solución de PBS, y reemplácelo con 350 mililitros de tampón de lisis como se incluye en los kits de aislamiento de ARN. Pipet el contenido hacia arriba y hacia abajo 20 veces para mezclar bien y preservar la calidad de la muestra. Para el almacenamiento y la conservación a largo plazo, transfiera las muestras a un congelador de menos 80 grados centígrados.
Use un kit de aislamiento de ARN y siga las instrucciones del fabricante para aislar y recolectar el ARN de las muestras de EPR antes de evaluar la calidad de la muestra mediante electroforesis. En nuestro estudio, las muestras de EPR recogidas mostraron ARN bien conservado con un número de integridad de ARN o RIN superior a ocho. El recuento total de ARN de alrededor de 240 nanogramos por ojo.
Se encontró que el nivel de expresión del gen específico del EPR, Rpe65, era significativamente mayor en las muestras de EPR que en la coroides y la esclerótica. En contraste, las muestras de EPR mostraron una expresión mínima del gen específico de la esclerótica coroidea seleccionado, colágeno tipo alfa-uno, lo que indica la ausencia de contaminantes coroideos y esclerales en las muestras aisladas de EPR. El paso más importante del procedimiento es la extracción suave de la retina sin dejar ningún fragmento de retina.
Este procedimiento de aislamiento de EPR justifica una explicación en estudios de cultivo celular in vitro con algunas diferencias importantes, incluida la elección de medios para sumergir las células de EPR después del aislamiento.
