Este estudio fue financiado por el Programa Clave de la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) y el Proyecto de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 32270988).

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Guía para el Uso y Cuidado de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Ética y Bienestar de Animales de Laboratorio de la Tercera Universidad Médica Militar.
1. Preparación de nanoemulsiones (NEs)
<ol><li>Para la preparación de la fase acuosa, disuelva 0,15 g de polisorbato 80 en 28,2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) mientras se agita a 40 °C.</li>
	<li>Para la preparación de la fase oleosa, utilice la formulación de la nanoemulsión en fase oleosa que se muestra en la Tabla 1. Disolver el sornitano trileado 85, DOTAP y RA en escualeno agitando a 40 °C.</li>
	<li>Para la preparación de la emulsión O/W primaria, agite la fase oleosa magnéticamente a 1400 rpm mientras agrega el acuoso lentamente y gota a gota a una velocidad de 1 mL/min. Preemulsionar la mezcla con un emulsionante de alto cizallamiento a 30.000 rpm durante 6 min.</li>
	<li>Para la homogeneización a alta presión (HPH), trate la emulsión O/W primaria preparada anteriormente con un homogeneizador de alta presión durante 12 ciclos a 900 bar para obtener una nanoemulsión homogénea en el rango de 160-190 nm.</li>
	<li>Al final del proceso, recoja la emulsión en un matraz de 50 ml y filtre la emulsión a través de una membrana filtrante de PES de 0,2 μm.</li>
	<li>Conecte el matraz a la línea Schlenk a través del catéter, girando la llave de paso de tres vías para conectar el sistema al tubo de vacío y encienda la bomba de vacío para crear vacío en el matraz. Luego, girando la llave de paso de tres vías, conecte el sistema al tubo de argón y llénelo con argón. Repita este paso 3 veces para asegurarse de que el matraz esté lleno de argón.</li>
	<li>Sustituya el corcho y séllelo con una película de parafina, envuelva el matraz en papel de aluminio y guárdelo a 4 °C.</li>
</ol>2. Caracterización de las nanoemulsiones
<ol><li>Detección de tamaño de partícula y potencial zeta<ol><li>Encienda el instrumento y espere 30 minutos para que la fuente de luz láser se estabilice.</li>
		<li>Diluir el NE 50 veces con agua ultrapura y añadir 1 mL de muestra a la celda de muestra correspondiente.</li>
		<li>Para medir el tamaño de partícula, ajuste la temperatura a 25 °C, seleccione agua como medio de dispersión y seleccione platos de plástico desechables como celda de medición. Cargue las muestras y mida automáticamente. Indique el valor medio de tres mediciones repetidas para cada muestra como resultado final.</li>
		<li>Para medir el potencial zeta, ajuste la temperatura a 25 °C. Debido a la elección de la fase acuosa como medio de dispersión, seleccione el modelo Smoluchowsi y la celda capilar plegada como celda de medición. Cargue las muestras y mida automáticamente. Indique la media de tres mediciones repetidas para cada muestra como resultado final.</li>
	</ol></li>
	<li>Determinación de la tasa de encapsulación y la tasa de carga del fármaco<ol><li>Para determinar la cantidad de RA cargada en el NE, utilice etanol absoluto para desemulsionar y extraer el RA del NE. A 5 μL de muestra, añadir 995 μL de etanol y determinar el contenido de RA de la solución utilizando un espectrofotómetro a 355 nm. Compare la absorbancia con una curva estándar. Utilice la siguiente ecuación: Encapsulación = carga real de AR/peso del fármaco añadido Tasa de carga del fármaco = carga real de AR / calidad de la muestra</li>
	</ol></li>
</ol>3. Procedimientos de inmunización y recogida de muestras
<ol><li>Procedimiento de inmunización y agrupamiento<ol><li>Grupo de ratones Balb/C hembra de 6-8 semanas de edad y con un peso aproximado de 18-21 g en grupos de 5 para la inmunización en el día 0, día 14, día 28 de acuerdo con los siguientes grupos experimentales: (1) grupo PBS, (2) grupo de ovoalbúmina (OVA), (3) grupo OVA+ NE-RA (OVA/ NE-RA), (4) grupo OVA+CNE-RA (OVA/CNE-RA).</li>
		<li>Inmunizar a todos los ratones mediante inyección intramuscular en los músculos del cuádriceps superior con 200 μL de diferentes formulaciones de vacunas: 100 μL de emulsión y 15 μg de OVA absorbidos en 100 μL de PBS, mezclados antes de la administración. Inyectar 100 μL/pata trasera. En el caso de los ratones del grupo de control, administre PBS solo.</li>
		<li>Eutanasia: Eutanasia a todos los ratones mediante una inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico al 1% 2 semanas después de completar las tres vacunas.</li>
		<li>Recolección y procesamiento de muestras: Después de la eutanasia, use tijeras para abrir el pecho de los ratones e inserte una jeringa directamente en el corazón para aspirar aproximadamente 0,5 ml de sangre completa. Deje reposar la sangre durante 2 h a temperatura ambiente y luego centrifugar a 1800 x g durante 5 min a 4 °C. Recoja el suero, la alícuota y guárdela a -80 °C para su posterior análisis.</li>
		<li>Recolectar sangre entera, bazo, líquido de lavado vaginal (VLF), líquido de lavado broncoalveolar (BALF), líquido de lavado nasal (NLF) y líquido de lavado del intestino delgado (SILF).</li>
	</ol></li>
	<li>Aislamiento de linfocitos esplénicos<ol><li>Remoje los ratones en etanol al 75% (v/v) para una breve esterilización, transfiera los ratones a un banco limpio. Cortar la piel del abdomen izquierdo con unas tijeras, exponer y retirar el bazo.</li>
		<li>Coloque el bazo en una placa de Petri que contenga 3 mL de PBS, muela y filtre en un tubo de centrífuga de 15 mL usando un tamiz (malla 200, 70 μm) y una varilla de molienda.</li>
		<li>Centrifugar las células a 650 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y suspenda el precipitado con 3 mL de solución de lisis de glóbulos rojos, incube a temperatura ambiente durante 5 min.</li>
		<li>Agregue 10 mL de PBS al tubo y agite bien para finalizar la reacción, luego centrifugue a 650 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 10 mL de PBS, agregue 20 μL de la dilución celular al contador de células automatizado para el recuento de células.</li>
		<li>Centrifugar las células a 650 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y diluya las células a 1 x 106 células/mL con medio completo 1640 (1% de penicilina-estreptomicina, 10% suero fetal bovino).</li>
	</ol></li>
	<li>Recolección de VLF: Enjuague la vagina 4 veces con 75 μL de 1%BSA/PBST, combine la solución de lavado y recoja en tubos de centrífuga de 1,5 mL, centrifugue a 5000 x g a 4 °C durante 20 min y recoja el sobrenadante con una pipeta y almacene a -80 °C.</li>
	<li>Colección BALF y NLF<ol><li>Desinfectar los ratones después del sacrificio con etanol al 75% (v/v). Sostenga el vientre del ratón hacia arriba y enderece el cuello. Use tijeras para hacer una incisión longitudinal en la piel del cuello del ratón y use pinzas para separar los músculos y exponer la tráquea adecuadamente.</li>
		<li>Corte la tráquea a través de una pequeña abertura transversal e inserte la manguera hacia los pulmones, conecte la jeringa a la manguera e inyecte 0,5 mL de PBS en los pulmones y retírelo, repita el enjuague 3 veces y centrifugue a 650 x g a 4 °C durante 5 min, almacene el sobrenadante (BALF) a -80 °C.</li>
		<li>Invierta la manguera a la cavidad nasal, conecte la jeringa a la manguera e inyecte 0,5 ml de PBS, el líquido fluirá a través de la cavidad nasal hacia el tubo de centrífuga de 1,5 ml. Aspire el lavado del tubo de centrífuga y repita el enjuague 2 veces, luego centrifugar a 650 x g a 4 °C durante 5 min, almacene el sobrenadante (NLF) a -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Colección SILF<ol><li>Prepare una solución de PBS que contenga 0,1 mg/ml de inhibidor de tripsina, 50 mM/L de EDTA-2Na, 1 mM/L de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) como solución de lavado del intestino delgado. Remover a temperatura ambiente para disolver y almacenar a 4 °C.</li>
		<li>Corte el intestino delgado a lo largo del tubo intestinal y sumérjalo en 3 ml de líquido de lavado del intestino delgado. Mezclar agitando verticalmente a 15 rpm durante 30 min a 4 °C. Centrifugar a 1440 x g a 4 °C durante 20 min y recoger el sobrenadante con una pipeta, luego centrifugar a 5000 x g a 4 °C durante 20 min. Almacene el sobrenadante (SILF) a -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Evaluación de la respuesta de anticuerpos específicos de OVA tras la administración intramuscular
<ol><li>Determinar los niveles séricos de IgG, las subclases de IgG1, IgG2a y los niveles de sIgA específica en VLF, BALF, NLF y SILF mediante ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA).</li>
	<li>Para el recubrimiento de antígenos, diluya OVA a 5 μg/mL con tampón de recubrimiento y cubra placas ELISA de 96 pocillos durante la noche a 4 °C con 100 μL de solución de OVA por pocillo.</li>
	<li>Lave las placas ELISA 5x con PBST y bloquee por incubación con 250 μL de 1%BSA/PBST a 37 °C durante 2 h.</li>
	<li>Lave las placas ELISA 5 veces con PBST, luego agregue 100 μL de la muestra diluida como se describe a continuación para analizar e incubar a 37 °C durante 1 h. Suero diluido, VLF, BALF, NLF con 0,5% BSA/PBST, SILF diluido con 20% de suero fetal de ternera (FCS)/PBST.<ol><li>Comience diluyendo el suero 1000x utilizando un procedimiento de dilución de dos pasos: diluya 20 μL de suero a 1 mL, luego diluya 25 μL de este suero diluido a 500 μL. Utilice esta dilución de suero para la detección de IgG1, IgG2a.</li>
	</ol></li>
	<li>Agregue 200 μL del suero diluido a 1000x a la primera fila de la placa recubierta y agregue 100 μL de 0.5% BSA/PBST a todos los pocillos excepto a la primera fila. Transfiera 100 μL de la primera fila a la segunda fila y mezcle 10x con la pipeta. Repetir este paso hasta la fila 8 y desechar 100 μL de líquido, se ha obtenido el suero de diferentes concentraciones para la detección de IgG.</li>
	<li>Realice una dilución 1:1 de BALF, NLF y SILF para detectar IgA. Utilice el mismo procedimiento de dilución para VLF que para el suero.</li>
	<li>Lave las placas ELISA 5 veces con PBST. Añadir 100 μL de IgG/IgG1/IgG2a/IgA anti-ratón de cabra conjugada con HRP (diluida 1:10000 con PBST) a los pocillos apropiados e incubar a 37 °C durante 40 min.</li>
	<li>Lavar las placas ELISA 5 veces con PBST, añadir 100 μL de sustrato ELISA de TMB (altamente sensible) y trasladar la placa a un lugar protegido de la luz durante 5 min. Añadir inmediatamente 100 μL de solución de parada de 450 nm para el sustrato TMB para detener la reacción.</li>
	<li>Mida la absorbancia (OD) a 450 nm para cada pocillo y calcule el título de anticuerpos tomando 2,1 veces el valor sérico del ratón del grupo en blanco como valor de respuesta positiva.</li>
</ol>5. Ensayo ELISpot
<ol><li>Siga las directrices de ELISpot Plus, utilice el IFN-γ de ratón (ALP) del kit para realizar los ensayos.</li>
	<li>Retire la placa del paquete sellado y lave 4 veces con PBS estéril (200 μL/pocillo). Acondicione la placa con medio completo 1640 (200 μL/pocillo) e incube durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire el medio y agregue la concentración ajustada de suspensión de linfocitos preparada en el paso 3.2.2 (100 μL/pocillo) a la placa, luego agregue 100 μL del estímulo, es decir, 1640 medio completo que contiene 20 μg/mL OVA257 ~ 264 o OVA323 ~ 339 o 1640 medio completo. Coloque la placa en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2 durante 48 h. Envuelva el plato con papel de aluminio para evitar la evaporación.</li>
	<li>Deseche la suspensión celular y lave la placa 5 veces con PBS (200 μL/pocillo). Diluir el anticuerpo de detección (R4-6A2-biotina) a 1 μg/mL en PBS que contenga 0,5% de suero fetal de ternero (PBS-0,5% FCS). Añadir 100 μL/pocillo e incubar durante 2 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave la placa como en el paso 5.2. Diluir la estreptavidina-ALP (1:1000) en PBS-0,5%FCS y añadir 100 μL/pocillo, incubar durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave la placa como en el paso 5.2. Filtre la solución de sustrato lista para usar (BCIP/NBT-plus) a través de un filtro de 0,45 μm y agregue 100 μL/pocillo. Se desarrollan hasta que emergen manchas distintivas.</li>
	<li>Detenga el desarrollo del color lavando abundantemente con agua del grifo, retire el plástico blando y deje que la placa se seque.</li>
	<li>Inspeccione y cuente los puntos en un lector ELISpot.</li>
</ol>6. Análisis estadístico
<ol><li>Analizar las diferencias entre los datos de 4 grupos mediante ANOVA de un factor seguido de una comparación múltiple de Tukey después de la prueba. Expresar todos los resultados como media ± DE. Se consideró significativo un valor de p menor a 0,05.</li>
</ol>

Evaluación de la inmunogenicidad del ácido retinoico encapsulado en nanoemulsión en ratones

<ol>
	<li>Pulendran, B., Arunachalam, P. S., O'Hagan, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+the+science+of+vaccine+adjuvants.">Emerging concepts in the science of vaccine adjuvants.</a> Nat Rev Drug Discov. 20 (6), 454-475 (2021).</li><li>Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoemulsion:+A+novel+drug+delivery+approach+for+enhancement+of+bioavailability.">Nanoemulsion: A novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability.</a> Recent Pat Nanotech. 14 (4), 276-293 (2020).</li><li>Chen, W. 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Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses en este trabajo.

En este protocolo, desarrollamos un ácido retinoico encapsulado en nanoemulsión catiónica para ser utilizado como adyuvante para promover respuestas sistémicas y mucosas específicas de antígenos. En comparación con los adyuvantes NE tradicionales, tiene las siguientes dos ventajas. En primer lugar, en general, la superficie de los NE O/W tiene una alta carga negativa, lo que dificulta la carga directa de antígenos. Las EN catiónicas pueden adsorber eficazmente antígenos de péptidos o proteínas y mejorar la in...

Los adyuvantes se utilizan a menudo para mejorar la eficacia de una vacuna al estimular el sistema inmunitario para que responda con más fuerza a la vacuna, aumentando así la inmunidad contra un patógeno enparticular. El adyuvante de nanoemulsión (NE) se refiere a un sistema de dispersión coloidal con estabilidad termodinámica mediante la emulsión de una cierta proporción de fase oleosa y fase acuosa para producir una emulsión en forma de agua en aceite (W/O) o aceite en agua (O/W)2. El adyuvante de nanoemulsión O/W puede producir citocinas y quimiocinas en el lugar de la inyección, inducir la rápida agregación y proliferación de células inmunitarias importantes como monocitos, neutrófilos y eosinófilos, y mejorar la respuesta inmunitaria y mejorar la inmunogenicidad de los antígenos3. Actualmente, tres adyuvantes de nanoemulsión (MF59, AS03 y AF03) han sido autorizados para su uso en vacunas y han demostrado una buena seguridad y eficacia4.
Sin embargo, la inmunidad de la mucosa ha sido mal abordada por las formulaciones adyuvantes actualmente autorizadas en la vacunación parenteral convencional5. Se ha informado que el ácido retinoico (AR) induce la localización intestinal de las células inmunitarias, pero su baja polaridad, su escasa solubilidad en agua y su escasa estabilidad lumínica y térmica limitan su uso para una vacunación entérica robusta. Las nanoemulsiones ofrecen oportunidades para aumentar la biodisponibilidad de fármacos altamente lipofílicos, y el núcleo de aceite de los adyuvantes de emulsión O/W es adecuado para disolver sustancias no polares como RA6. Por lo tanto, las nanoemulsiones se pueden utilizar como portadores de la AR con el fin de lograr el efecto de doble respuesta de la inmunidad sistémica y la inmunidad de la mucosa.
En comparación con los sistemas de administración neutros o aniónicos, los sistemas de administración catiónica tienen capacidades de encapsulación y administración de antígenos relativamente eficientes, lo que puede mejorar la inmunogenicidad de los antígenos 7,8,9. La carga superficial catiónica de una variedad de sistemas adyuvantes es importante por sus efectos adyuvantes 10,11,12. La carga catiónica es un factor importante para prolongar la retención de la vacuna en el lugar de la inyección, aumentando la presentación de antígenos y prolongando la estimulación de la inmunidad celular en el cuerpo12.
Sobre la base de las consideraciones anteriores, desarrollamos una nanoemulsión catiónica para administrar conjuntamente ARA y antígenos de manera efectiva. El tamaño de partícula y el potencial zeta de la nanoemulsión se determinaron mediante dispersión dinámica de luz (DLS), y las respuestas inmunes sistémicas y mucosas de la nanoemulsión combinada con OVA se evaluaron mediante inyección intramuscular13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1640 medium</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>450 nm Stop Solution for TMB Substrate</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab171529-1000 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>Countstar, China</td>
			<td>IC1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>B2064-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>5811000398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Danamic Light Scattering</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Zetasizer Nano S90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOTAP</td>
			<td>CordenPharma, Switzerland</td>
			<td>O02002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP)</td>
			<td>mabtech</td>
			<td>ab205719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>10099141C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full-function Microplate Reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>VL0000D2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG1(HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97240-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97235-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab205720-500ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat&#160;Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97245-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure homogenizer</td>
			<td>ATS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONTANE 85 PPI</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>L12910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONTANOX 80 PPI</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>36372K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVA257&#8211;264</td>
			<td>Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVA323-339</td>
			<td>Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>ZSGB-bio</td>
			<td>ZLI-9061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>R1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>retinoic acid</td>
			<td>TCI, Japan</td>
			<td>TCI-R0064-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squalene</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>S3626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T10 basic Ultra-Turrax</td>
			<td>IKA, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB ELISA Substrate</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab171523-1000ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin inhibitor</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>A003570-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Macklin, China</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>U-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cationic nanoemulsion-encapsulated retinoic acid as an adjuvant to promote ova&#45;specific systemic and mucosal responses

Las nanoestructuras catiónicas han surgido como un adyuvante y sistema de administración de antígenos que mejora la maduración de las células dendríticas, la generación de ROS y la absorción de antígenos y, a continuación, promueve respuestas inmunitarias específicas de antígenos. En los últimos años, el ácido retinoico (AR) ha recibido cada vez más atención debido a su efecto en la activación de la respuesta inmunitaria de la mucosa; sin embargo, para utilizar la AR como adyuvante de la mucosa, es necesario resolver el problema de su disolución, carga y administración. Aquí, describimos un sistema de administración de ácido retinoico encapsulado en nanoemulsión catiónica (CNE-RA) compuesto por el lípido catiónico 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOTAP), ácido retinoico, escualeno como fase oleosa, polisorbato 80 como surfactante y trioleato de sorbitán 85 como co-surfactante. Sus propiedades físicas y químicas se caracterizaron mediante dispersión dinámica de luz y un espectrofotómetro. La inmunización de ratones con la mezcla de antígeno (ovoalbúmina, OVA) y CNE-RA elevó significativamente los niveles de inmunoglobulina A secretora anti-OVA (sIgA) en el líquido de lavado vaginal y en el líquido de lavado del intestino delgado de ratones en comparación con OVA solo. Este protocolo describe un método detallado para la preparación, caracterización y evaluación del efecto adyuvante de la CNE-RA.

Adjuvants are often used to enhance the efficacy of a vaccine by stimulating the immune system to respond more strongly to the vaccine, thereby increasing immunity to a particular pathogen1. Nanoemulsion (NE) adjuvant refers to a colloidal dispersion system with thermodynamic stability by emulsifying a certain proportion of oil phase and aqueous phase to produce an emulsion in the form of water-in-oil (W/O) or oil-in-water (O/W)2. O/W nanoemulsion adjuvant can produce cytokines and chemokines at the injection site, induce the rapid aggregation and proliferation of important immune cells such as monocytes, neutrophils, and eosinophils, and enhance the immune response, and improve the immunogenicity of antigens3. Currently, three nanoemulsion adjuvants (MF59, AS03, and AF03) have been licensed for use in vaccines and have shown good safety and efficacy4.
However, mucosal immunity has been poorly addressed by the currently licensed adjuvant formulations in conventional parenteral vaccination5. Retinoic acid (RA) has been reported to induce intestinal homing of immune cells, but its low polarity, poor solubility in water, and poor light and thermal stability limit its use for robust enteric vaccination. Nanoemulsions offer opportunities to increase the bioavailability of highly lipophilic drugs, and the oil core of O/W emulsion adjuvants is suitable for dissolving non-polar substances such as RA6. Therefore, nanoemulsions can be used as carriers for RA in order to achieve the dual response effect of systemic immunity and mucosal immunity.
Compared to neutral or anionic delivery systems, cationic delivery systems have relatively efficient antigen encapsulation and delivery capabilities, which can enhance the immunogenicity of antigens7,8,9. The cationic surface charge of a variety of adjuvant systems is important for their adjuvant effects10,11,12. The cationic charge is an important factor in prolonging vaccine retention at the injection site, increasing antigen presentation and prolonging the stimulation of cellular immunity in the body12.
Based on the above considerations, we developed a cationic nanoemulsion to effectively co-deliver RA and antigens. The particle size and zeta potential of the nanoemulsion were determined using dynamic light scattering (DLS), and the systemic and mucosal immune responses of the nanoemulsion combined with OVA were evaluated by intramuscular injection13.

Autor destacado: Desarrollo y evaluación de un sistema de ácido retinoico encapsulado en nanoemulsión catiónica para la vacunación de mucosas

Ácido retinoico encapsulado en nanoemulsión catiónica como adyuvante para promover respuestas sistémicas y mucosas específicas de OVA

En total, se prepararon cuatro formulaciones de nanoemulsión y se caracterizaron por su tamaño de partícula (Figura 1), su potencial zeta y su eficiencia de encapsulación como se presenta en la Tabla 2. El tamaño de partícula se concentró alrededor de 160-190 nm y la adición de DOTAP invirtió el potencial Zeta de la nanoemulsión. Se detectó IgG sérica específica de OVA y su subgrupo de niveles de anticuerpos en suero 2 semanas después de la tercera inmunizació...

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En este protocolo, desarrollamos un ácido retinoico (AR) encapsulado en nanoemulsión catiónica para ser utilizado como adyuvante para promover respuestas sistémicas y mucosas específicas de antígeno. Al agregar el AR aprobado por la FDA a la nanoemulsión, se promovió la sIgA específica del antígeno en la vagina y el intestino delgado después de la inyección intramuscular de la nanoemulsión.

Cationic nanostructures have emerged as an adjuvant and antigen delivery system that enhances dendritic cell maturation, ROS generation, and antigen ...

Estamos trabajando en una vacuna contra la mucosa que produzca una respuesta inmunitaria como el conjunto de la infección, que tiene el potencial de prevenir la infección e interrumpir la transmisión. Hemos desarrollado un sistema de administración de ácido retinoico encapsulado en nanoemulsión catatónica para la inmunización con ovoalbúmina por inyección intramuscular, que desencadena respuestas inmunitarias sistémicas y mucosas. En estudios futuros, se pueden utilizar modelos animales de enfermedades relacionadas con el intestino para evaluar más a fondo el efecto y el mecanismo de un ácido retinoico encapsulado en nanoemulsión catiónica para mejorar la protección de la vacuna.

cationic-nanoemulsion-encapsulated-retinoic-acid-as-an-adjuvant-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cationic Nanoemulsion-Encapsulated Retinoic Acid as an Adjuvant to Promote OVA&#45;Specific Systemic and Mucosal Responses

431 vistas.  Third Military Medical University. Estamos trabajando en una vacuna contra la mucosa que produzca una respuesta inmunitaria como el conjunto de la infección, que tiene el potencial de prevenir la infección e interrumpir la transmisión. Hemos desarrollado un sistema de administración de ácido retinoico encapsulado en nanoemulsión catatónica para la inmunización con ovoalbúmina por inyección intramuscular, que desencadena respuestas inmunitarias sistémicas y mucosas. En estudios futuros, se pueden utilizar modelos ani...

Video: Autor destacado: Desarrollo y evaluación de un sistema de ácido retinoico encapsulado en nanoemulsión catiónica para la vacunación de mucosas

Cationic nanostructures have emerged as an adjuvant and antigen delivery system that enhances dendritic cell maturation, ROS generation, and antigen uptake and then promotes antigen-specific immune responses. In recent years, retinoic acid (RA) has received increasing attention due to its effect in activating the mucosal immune response; however, in order to use RA as a mucosal adjuvant, it is necessary to solve the problem of its dissolution, loading, and delivery. Here, we describe a cationic nanoemulsion-encapsulated retinoic acid (CNE-RA) delivery system composed of the cationic lipid 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOTAP), retinoic acid, squalene as the oil phase, polysorbate 80 as surfactant, and sorbitan trioleate 85 as co-surfactant. Its physical and chemical properties were characterized using dynamic light scattering and a spectrophotometer. Immunization of mice with the mixture of antigen (ovalbumin, OVA) and CNE-RA significantly elevated the levels of anti-OVA secretory immunoglobulin A (sIgA) in vaginal lavage fluid and the small intestinal lavage fluid of mice compared with OVA alone. This protocol describes a detailed method for the preparation, characterization, and evaluation of the adjuvant effect of CNE-RA.

In this protocol, we developed a cationic nanoemulsion-encapsulated retinoic acid (RA) to be used as an adjuvant to promote antigen-specific systemic and mucosal responses. By adding the FDA-approved RA to the nanoemulsion, antigen-specific sIgA was promoted in the vagina and small intestine after intramuscular injection of the nanoemulsion.

Investigación

Inmunología e Infección

Preparation and Characterization of Cationic Nanoemulsion&#45;Encapsulated Retinoic Acid

Preparación y caracterización de ácido retinoico encapsulado en nanoemulsión catiónica

Evaluation of Ovalbumin-Specific Antibodies in Mice After Intramuscular Administration of Cationic Nanoemulsion&#45;Encapsulated Retinoic Acid

Evaluación de anticuerpos específicos contra la ovoalbúmina en ratones después de la administración intramuscular de ácido retinoico encapsulado en nanoemulsión catiónica