Bu çalışma, Chongqing Doğa Bilimleri Vakfı Anahtar Programı (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Projesi (No. 32270988) tarafından finanse edilmiştir.

Hayvan deneyleri, Laboratuvar Hayvanlarının Kullanımı ve Bakımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Üçüncü Askeri Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Refahı ve Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır.
1. Nanoemülsiyonların (NE'ler) hazırlanması
<ol><li>Sulu faz hazırlığı için, 40 ° C'de karıştırırken 0.15 g polisorbat 80'i 28.2 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözün.</li>
	<li>Yağ fazı hazırlığı için, Tablo 1'de gösterilen nanoemülsiyonun yağ fazı formülasyonunu kullanın. Sornitan trileat 85, DOTAP ve RA'yı 40 °C'de karıştırarak skualen içinde çözün.</li>
	<li>Birincil O / W emülsiyon hazırlığı için, yağ fazını 1400 rpm'de manyetik olarak karıştırın ve suluyu 1 mL / dak hızında yavaş ve damla damla ekleyin. Karışımı 6 dakika boyunca 30.000 rpm'de yüksek parçalayıcılı bir emülgatör kullanarak önceden emülsifiye edin.</li>
	<li>Yüksek basınçlı homojenizasyon (HPH) için, 160-190 nm aralığında homojen bir nano emülsiyon elde etmek için yukarıda hazırlanan birincil O/W emülsiyonunu yüksek basınçlı homojenizatör ile 900 bar'da 12 döngü boyunca işlemden geçirin.</li>
	<li>İşlemin sonunda, emülsiyonu 50 mL'lik bir şişede toplayın ve emülsiyonu 0,2 μm'lik bir PES filtre membranından filtreyle sterilize edin.</li>
	<li>Şişeyi kateter aracılığıyla Schlenk Hattına bağlayın, sistemi vakum tüpüne bağlamak için üç vanayı döndürün ve şişede vakum oluşturmak için vakum pompasını açın. Ardından, üç vanayı döndürerek sistemi Argon tüpüne bağlayın ve Argon ile doldurun. Şişenin Argon ile doldurulduğundan emin olmak için bu adımı 3 kez tekrarlayın.</li>
	<li>Mantarı değiştirin ve bir parafin film ile kapatın, şişeyi kalay folyoya sarın ve 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>2. Nanoemülsiyonların karakterizasyonu
<ol><li>Partikül boyutu ve zeta potansiyeli tespiti<ol><li>Cihazı AÇIN ve lazer ışık kaynağının sabitlenmesi için 30 dakika bekleyin.</li>
		<li>NE'yi 50 kat ultra saf suyla seyreltin ve karşılık gelen numune hücresine 1 mL numune ekleyin.</li>
		<li>Partikül boyutunu ölçmek için sıcaklığı 25 °C'ye ayarlayın, dispersiyon ortamı olarak suyu seçin ve ölçüm hücresi olarak tek kullanımlık plastik tabakları seçin. Numuneleri yükleyin ve otomatik olarak ölçün. Nihai sonuç olarak her numune için tekrarlanan üç ölçümün ortalama değerini rapor edin.</li>
		<li>Zeta potansiyelinin ölçümü için sıcaklığı 25 °C'ye ayarlayın. Dispersiyon ortamı olarak sulu fazın seçilmesi nedeniyle, ölçüm hücresi olarak Smoluchowsi modelini ve katlanmış kılcal hücreyi seçin. Numuneleri yükleyin ve otomatik olarak ölçün. Nihai sonuç olarak her numune için üç tekrarlanan ölçümün ortalamasını raporlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kapsülleme oranı ve ilaç yükleme hızının belirlenmesi<ol><li>NE'ye yüklenen RA miktarını belirlemek için, RA'yı NE'den emülsifiye etmek ve çıkarmak için mutlak etanol kullanın. 5 μL numuneye 995 μL etanol ekleyin ve 355 nm'de bir spektrofotometre kullanarak çözeltinin RA içeriğini belirleyin. Absorbansı standart bir eğri ile karşılaştırın. Aşağıdaki denklemi kullanın: Kapsülleme = gerçek RA yükü / eklenen ilacın ağırlığı İlaç yükleme hızı = gerçek RA yüklemesi / numunenin kalitesi</li>
	</ol></li>
</ol>3. Bağışıklama prosedürleri ve numune toplama
<ol><li>Bağışıklama prosedürü ve gruplama<ol><li>Aşağıdaki deney gruplarına göre 0. gün, 14. gün, 28. günde aşılama için 6-8 haftalık ve yaklaşık 18-21 g ağırlığındaki dişi Balb/C farelerini 5'li setler halinde gruplayın: (1) PBS grubu, (2) ovalbümin (OVA) grubu, (3) OVA+ NE-RA (OVA/ NE-RA) grubu, (4) OVA+CNE-RA(OVA/CNE-RA) grubu.</li>
		<li>Tüm fareleri, 200 μL farklı aşı formülasyonları ile üst kuadriseps kaslarına intramüsküler enjeksiyonla aşılayın: 100 μL emülsiyon ve 100 μL PBS içinde emilen 15 μg OVA, uygulamadan önce karıştırılır. 100 μL / arka bacak enjekte edin. Kontrol grubundaki fareler için PBS'yi tek başına uygulayın.</li>
		<li>Ötenazi: Üç aşılamanın tamamlanmasından 2 hafta sonra tüm fareleri 100 mg / kg% 1 sodyum pentobarbital intraperitoneal enjeksiyonla ötenazi yapın.</li>
		<li>Numune toplama ve işleme: Ötenaziden sonra, farelerin göğsünü kesmek için makas kullanın ve yaklaşık 0.5 mL tam kan aspire etmek için doğrudan kalbe bir şırınga yerleştirin. Kanın oda sıcaklığında 2 saat bekletin ve ardından 1800 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Serum, alikot toplayın ve daha fazla analiz için -80 ° C'de saklayın.</li>
		<li>Tam kan, dalak, vajinal lavaj sıvısı (VLF), bronkoalveoler lavaj sıvısı (BALF), nazal lavaj sıvısı (NLF) ve ince bağırsak lavaj sıvısını (SILF) toplayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Dalak lenfositlerinin izolasyonu<ol><li>Fareleri etanole batırın %75 (h/h) Kısa bir sterilizasyon için fareleri temiz bir tezgaha aktarın. Sol karın bölgesindeki cildi makasla kesin, dalağı açığa çıkarın ve çıkarın.</li>
		<li>Dalağı 3 mL PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin, öğütün ve bir elek (200 göz, 70 μm) ve öğütme çubuğu kullanarak 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne süzün.</li>
		<li>Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 650 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve çökeltiyi 3 mL kırmızı kan hücresi lizis çözeltisi ile askıya alın, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Tüpe 10 mL PBS ekleyin ve reaksiyonu sonlandırmak için iyice çalkalayın, ardından oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 650 x g'da santrifüjleyin.</li>
		<li>Süpernatanı atın ve hücreleri 10 mL PBS'de yeniden süspanse edin, hücre sayımı için otomatik hücre sayacına 20 μL hücre seyreltmesi ekleyin.</li>
		<li>Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 650 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri 1640 tam ortam (% 1 penisilin-streptomisin,% 10 fetal sığır serumu) ile 1 x10 6 hücre / mL'ye seyreltin.</li>
	</ol></li>
	<li>VLF toplama: Vajinayı 4x 75 μL %1 BSA/PBST ile durulayın, lavaj solüsyonunu birleştirin ve 1.5 mL santrifüj tüplerinde toplayın, 5000 x g'da 4 ° C'de 20 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı bir pipetle toplayın ve -80 ° C'de saklayın.</li>
	<li>BALF ve NLF koleksiyonu<ol><li>Kurban edildikten sonra fareleri %75 (h/h) etanol ile dezenfekte edin. Farenin karnını yukarıda tutun ve boynunu düzeltin. Fare boynunun derisinde uzunlamasına bir kesi yapmak için makas kullanın ve kasları ayırmak ve trakeayı yeterince açığa çıkarmak için forseps kullanın.</li>
		<li>Trakeayı küçük bir enine açıklıktan kesin ve hortumu akciğerlere doğru yerleştirin, şırıngayı hortuma takın ve akciğerlere 0,5 mL PBS enjekte edin ve geri çekin, durulamayı 3x tekrarlayın ve 650 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin, süpernatanı (BALF) -80 ° C'de saklayın.</li>
		<li>Hortumu burun boşluğuna ters çevirin, şırıngayı hortuma takın ve 0,5 mL PBS enjekte edin, sıvı burun boşluğundan 1,5 mL santrifüj tüpüne akacaktır. Yıkamayı santrifüj tüpünden aspire edin ve durulamayı 2 kez tekrarlayın, ardından 650 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin, süpernatanı (NLF) -80 ° C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>SILF koleksiyonu<ol><li>İnce bağırsak lavaj çözeltisi olarak 0.1 mg / mL tripsin inhibitörü, 50 mM / L EDTA-2Na, 1 mM / L fenilmetilsülfonil florür (PMSF) içeren PBS çözeltisi hazırlayın. Çözünmesi için oda sıcaklığında karıştırın ve 4 °C'de saklayın.</li>
		<li>İnce bağırsağı bağırsak borusu boyunca kesin ve 3 mL ince bağırsak lavaj sıvısına daldırın. 4 °C'de 30 dakika boyunca 15 rpm'de dikey çalkalayarak karıştırın. 20 dakika boyunca 4 ° C'de 1440 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı bir pipetle toplayın, ardından 20 dakika boyunca 4 ° C'de 5000 x g'de santrifüjleyin. Süpernatanı (SILF) -80 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. İntramüsküler uygulamadan sonra OVA'ya özgü antikor yanıtının değerlendirilmesi
<ol><li>Enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile IgG'nin serum düzeylerini, IgG1, IgG2a'nın alt sınıflarını ve VLF, BALF, NLF ve SILF'deki spesifik sIgA düzeylerini belirleyin.</li>
	<li>Antijen kaplaması için, OVA'yı kaplama tamponu ile 5 μg/mL'ye seyreltin ve 96 oyuklu ELISA plakalarını gece boyunca 4 °C'de oyuk başına 100 μL OVA çözeltisi ile kaplayın.</li>
	<li>ELISA plakalarını 5x PBST ile yıkayın ve 250 μL %1 BSA/PBST ile 37 °C'de 2 saat inkübe ederek bloke edin.</li>
	<li>ELISA plakalarını 5x PBST ile yıkayın, ardından test edilmek üzere aşağıda açıklandığı gibi seyreltilmiş numuneden 100 μL ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. Serum, VLF, BALF, NLF'yi %0.5 BSA/PBST ile seyreltin, SILF'i %20 fetal buzağı serumu (FCS)/PBST ile seyreltin.<ol><li>İki aşamalı bir seyreltme prosedürü kullanarak serumu 1000x seyrelterek başlayın: 20 μL serumu 1 mL'ye seyreltin, ardından bu seyreltilmiş serumun 25 μL'sini 500 μL'ye seyreltin. IgG1, IgG2a'nın tespiti için bu serum seyreltmesini kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kaplanmış plakanın ilk sırasına 1000x'te seyreltilmiş 200 μL serum ekleyin ve ilk sıra hariç tüm oyuklara 100 μL% 0.5 BSA / PBST ekleyin. İlk sıradan ikinci sıraya 100 μL aktarın ve 10x'i pipetle karıştırın. Bu adımı 8. sıraya kadar tekrarlayın ve 100 μL sıvıyı atın, IgG'nin tespiti için farklı konsantrasyonlarda serum elde edilmiştir.</li>
	<li>IgA'yı tespit etmek için BALF, NLF ve SILF'nin 1: 1 seyreltmesini gerçekleştirin. VLF için serum ile aynı seyreltme prosedürünü kullanın.</li>
	<li>ELISA plakalarını 5x PBST ile yıkayın. Uygun kuyucuklara 100 μL HRP konjuge keçi fare karşıtı IgG / IgG1 / IgG2a / IgA (PBST ile 1:10000 seyreltilmiş) ekleyin ve 37 ° C'de 40 dakika inkübe edin.</li>
	<li>ELISA plakalarını 5x PBST ile yıkayın, 100 μL TMB ELISA substratı (çok hassas) ekleyin ve plakayı 5 dakika boyunca ışıktan korunan bir yere aktarın. Reaksiyonu durdurmak için TMB substratı için hemen 100 μL 450 nm durdurma çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Her kuyucuk için 450 nm'de absorbansı (OD) ölçün ve pozitif yanıt değeri olarak boş grup farenin serum değerinin 2.1 katını alarak antikor titresini hesaplayın.</li>
</ol>5. ELISpot testi
<ol><li>ELISpot Plus yönergelerini izleyin, tahlilleri gerçekleştirmek için kitten Fare IFN-γ (ALP) kullanın.</li>
	<li>Plakayı kapalı ambalajından çıkarın ve 4x'i steril PBS (200 μL/kuyu) ile yıkayın. Plakayı 1640 tam ortam (200 μL / kuyu) ile şartlandırın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Ortamı çıkarın ve adım 3.2.2'de (100 μL / kuyucuk) hazırlanan ayarlanmış lenfosit süspansiyon konsantrasyonunu plakaya ekleyin, daha sonra 100 μL uyaran ekleyin, yani 20 μg / mL OVA257 ~ 264 veya OVA323 ~ 339 veya 1640 tam ortam içeren 1640 tam ortam. Plakayı 37 ° C'de% 5 CO2 ile 48 saat boyunca nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin. Buharlaşmayı önlemek için plakayı alüminyum folyo ile sarın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu atın ve plakayı 5x PBS (200 μL/kuyu) ile yıkayın. Tespit antikorunu (R4-6A2-biotin)% 0.5 fetal buzağı serumu (PBS-% 0.5 FCS) içeren PBS'de 1 μg / mL'ye seyreltin. 100 μL/kuyu ekleyin ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.</li>
	<li>Plakayı adım 5.2'deki gibi yıkayın. Streptavidin-ALP'yi (1:1000) PBS-0.5% FCS içinde seyreltin ve 100 μL / kuyu ekleyin, oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>Plakayı adım 5.2'deki gibi yıkayın. Kullanıma hazır substrat çözeltisini (BCIP/NBT-plus) 0,45 μm'lik bir filtreden süzün ve 100 μL/kuyucuk ekleyin. Farklı noktalar ortaya çıkana kadar geliştirin.</li>
	<li>Musluk suyunda yoğun bir şekilde yıkayarak renk oluşumunu durdurun, yumuşak plastiği çıkarın ve plakayı kurumaya bırakın.</li>
	<li>Bir ELISpot okuyucusunda noktaları inceleyin ve sayın.</li>
</ol>6. İstatistiksel analiz
<ol><li>4 grubun verileri arasındaki farklılıklar tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey çoklu karşılaştırma son testi ile analiz edilmiştir. Tüm sonuçları ortalama ± SD olarak ifade edin. P değerinin 0.05'ten küçük olması anlamlı kabul edildi.</li>
</ol>

Farelerde Nanoemülsiyon Kapsüllü Retinoik Asidin İmmünojenisitesinin Değerlendirilmesi

<ol>
	<li>Pulendran, B., Arunachalam, P. S., O'Hagan, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+the+science+of+vaccine+adjuvants.">Emerging concepts in the science of vaccine adjuvants.</a> Nat Rev Drug Discov. 20 (6), 454-475 (2021).</li><li>Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoemulsion:+A+novel+drug+delivery+approach+for+enhancement+of+bioavailability.">Nanoemulsion: A novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability.</a> Recent Pat Nanotech. 14 (4), 276-293 (2020).</li><li>Chen, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disintegration+and+cancer+immunotherapy+efficacy+of+a+squalane-in-water+delivery+system+emulsified+by+bioresorbable+poly(ethylene+glycol)-block-polylactide.">Disintegration and cancer immunotherapy efficacy of a squalane-in-water delivery system emulsified by bioresorbable poly(ethylene glycol)-block-polylactide.</a> Biomaterials. 35 (5), 1686-1695 (2014).</li><li>Iwasaki, A., Omer, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+and+how+vaccines+work.">Why and how vaccines work.</a> Cell. 183 (2), 290-295 (2020).</li><li>Spadoni, I., Fornasa, G., Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+protection+mediated+by+cooperation+between+vascular+and+epithelial+barriers.">Organ-specific protection mediated by cooperation between vascular and epithelial barriers.</a> Nat Rev Immunol. 17 (12), 761-773 (2017).</li><li>Singh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoemulsion:+Concepts,+development+and+applications+in+drug+delivery.">Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery.</a> J Cont Release. 252, 28-49 (2017).</li><li>Yan, W. L., Chen, W. S., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+adjuvant+activity+of+cationic+liposome:+Phosphorylation+of+a+MAP+kinase,+ERK+and+induction+of+chemokines.">Mechanism of adjuvant activity of cationic liposome: Phosphorylation of a MAP kinase, ERK and induction of chemokines.</a> Mol Immunol. 44 (15), 3672-3681 (2007).</li><li>Korsholm, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adjuvant+mechanism+of+cationic+dimethyldioctadecylammonium+liposomes.">The adjuvant mechanism of cationic dimethyldioctadecylammonium liposomes.</a> Immunology. 121 (2), 216-226 (2007).</li><li>Agger, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+liposomes+formulated+with+synthetic+mycobacterial+cordfactor+(CAF01):+A+versatile+ddjuvant+for+vaccines+with+different+immunological+requirements.">Cationic liposomes formulated with synthetic mycobacterial cordfactor (CAF01): A versatile ddjuvant for vaccines with different immunological requirements.</a> Plos One. 3 (9), e3116 (2008).</li><li>Slutter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+vaccination+with+N-trimethyl+chitosan+and+PLGA+based+nanoparticles:+Nanoparticle+characteristics+determine+quality+and+strength+of+the+antibody+response+in+mice+against+the+encapsulated+antigen.">Nasal vaccination with N-trimethyl chitosan and PLGA based nanoparticles: Nanoparticle characteristics determine quality and strength of the antibody response in mice against the encapsulated antigen.</a> Vaccine. 28 (38), 6282-6291 (2010).</li><li>Nochi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanogel+antigenic+protein-delivery+system+for+adjuvant-free+intranasal+vaccines.">Nanogel antigenic protein-delivery system for adjuvant-free intranasal vaccines.</a> Nat Mater. 9 (8), 685-685 (2010).</li><li>Henriksen-Lacey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+cationic+charge+and+antigen+adsorption+are+important+properties+for+the+efficient+deposition+of+antigen+at+the+injection+site+and+ability+of+the+vaccine+to+induce+a+CMI+response.">Liposomal cationic charge and antigen adsorption are important properties for the efficient deposition of antigen at the injection site and ability of the vaccine to induce a CMI response.</a> J Control Release. 145 (2), 102-108 (2010).</li><li>Zhong, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanovaccines+mediated+subcutis-to-intestine+cascade+for+improved+protection+against+intestinal+infections.">Nanovaccines mediated subcutis-to-intestine cascade for improved protection against intestinal infections.</a> Small. 18 (1), e2105530 (2022).</li><li>Mora, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+gut-homing+IgA-secreting+B+cells+by+intestinal+dendritic+cells.">Generation of gut-homing IgA-secreting B cells by intestinal dendritic cells.</a> Science. 314 (5802), 1157-1160 (2006).</li><li>Iwata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells.">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).</li><li>Hammerschmidt, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+induces+homing+of+protective+T+and+B+cells+to+the+gut+after+subcutaneous+immunization+in+mice.">Retinoic acid induces homing of protective T and B cells to the gut after subcutaneous immunization in mice.</a> J Clin Invest. 121 (8), 3051-3061 (2011).</li><li>Burger, C., Shahzad, Y., Br&#252;mmer, A., Gerber, M., du Plessis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traversing+the+skin+barrier+with+nano-emulsions.">Traversing the skin barrier with nano-emulsions.</a> Curr Drug Deliv. 14 (4), 458-472 (2017).</li><li>Lodaya, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+design,+optimization+and+evaluations+of+an+&#945;-tocopherol-containing+self-emulsified+adjuvant+system+using+inactivated+influenza+vaccine.">Formulation design, optimization and evaluations of an &#945;-tocopherol-containing self-emulsified adjuvant system using inactivated influenza vaccine.</a> J Cont Release. 316, 12-21 (2019).</li><li>Carmona-Ribeiro, A. M., P&#233;rez-Betancourt, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+nanostructures+for+vaccines+design.">Cationic nanostructures for vaccines design.</a> Biomimetics. 5 (3), 32 (2020).</li><li>Lam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=trialkyl+ionizable+lipids+are+versatile+lipid-nanoparticle+components+for+therapeutic+and+vaccine+applications.">trialkyl ionizable lipids are versatile lipid-nanoparticle components for therapeutic and vaccine applications.</a> Adv Mater. 35 (15), e2209624 (2023).</li><li>Nie, T. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+coating+approach+to+overcome+mucosal+entrapment+of+DNA+nanoparticles+for+oral+gene+delivery+of+glucagon-like+peptide+1.">Surface coating approach to overcome mucosal entrapment of DNA nanoparticles for oral gene delivery of glucagon-like peptide 1.</a> Acs Appl Mater Inter. 11 (33), 29593-29603 (2019).</li><li>Lou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+self-amplifying+mRNA+vaccines+by+cationic+lipid+nanoparticles:+The+impact+of+cationic+lipid+selection.">Delivery of self-amplifying mRNA vaccines by cationic lipid nanoparticles: The impact of cationic lipid selection.</a> J Cont Release. 325, 370-379 (2020).</li></ol>

Yazarlar bu çalışmada herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Bu protokolde, antijene özgü sistemik ve mukozal yanıtları teşvik etmek için adjuvan olarak kullanılmak üzere katyonik nanoemülsiyon kapsüllü retinoik asit geliştirdik. Geleneksel NE adjuvanları ile karşılaştırıldığında, aşağıdaki iki avantaja sahiptir. İlk olarak, genel olarak, O/W NE'lerin yüzeyi yüksek bir negatif yüke sahiptir, bu da antijenlerin doğrudan yüklenmesini zorlaştırır. Katyonik NE'ler, peptit veya protein antijenlerini etkili bir şekilde adsorbe edebilir ve spesifik immü...

Adjuvanlar genellikle bağışıklık sistemini aşıya daha güçlü yanıt vermesi için uyararak ve böylece belirli bir patojene karşı bağışıklığı artırarak bir aşının etkinliğini arttırmak için kullanılır1. Nanoemülsiyon (NE) adjuvanı, yağda su (W/O) veya suda yağ (O/W)2 şeklinde bir emülsiyon üretmek için belirli bir oranda yağ fazı ve sulu fazı emülsifiye ederek termodinamik stabiliteye sahip bir kolloidal dispersiyon sistemini ifade eder. O / W nanoemülsiyon adjuvanı, enjeksiyon bölgesinde sitokinler ve kemokinler üretebilir, monositler, nötrofiller ve eozinofiller gibi önemli bağışıklık hücrelerinin hızlı agregasyonunu ve proliferasyonunu indükleyebilir ve bağışıklık tepkisini artırabilir ve antijenlerin immünojenisitesini artırabilir3. Şu anda, üç nanoemülsiyon adjuvanı (MF59, AS03 ve AF03) aşılarda kullanım için lisanslanmıştır ve iyi güvenlik ve etkinlik göstermiştir4.
Bununla birlikte, mukozal bağışıklık, konvansiyonel parenteral aşılamada şu anda lisanslı adjuvan formülasyonlar tarafından yetersiz bir şekilde ele alınmıştır5. Retinoik asidin (RA) bağışıklık hücrelerinin bağırsak güdümünü indüklediği bildirilmiştir, ancak düşük polaritesi, suda zayıf çözünürlüğü ve zayıf ışık ve termal stabilitesi, sağlam enterik aşılama için kullanımını sınırlar. Nanoemülsiyonlar, yüksek derecede lipofilik ilaçların biyoyararlanımını arttırma fırsatları sunar ve O / W emülsiyon adjuvanlarının yağ çekirdeği, RA6 gibi polar olmayan maddelerin çözülmesi için uygundur. Bu nedenle, nanoemülsiyonlar, sistemik bağışıklık ve mukozal bağışıklığın ikili yanıt etkisini elde etmek için RA için taşıyıcı olarak kullanılabilir.
Nötr veya anyonik dağıtım sistemleriyle karşılaştırıldığında, katyonik dağıtım sistemleri, antijenlerin 7,8,9 immünojenisitesini artırabilen nispeten verimli antijen kapsülleme ve verme yeteneklerine sahiptir. Çeşitli adjuvan sistemlerin katyonik yüzey yükü, adjuvan etkileri için önemlidir 10,11,12. Katyonik yük, enjeksiyon bölgesinde aşı tutulma süresinin uzaması, antijen sunumunun arttırılması ve vücuttaki hücresel bağışıklığın uyarılmasının uzamasında önemli bir faktördür12.
Yukarıdaki hususlara dayanarak, RA ve antijenleri etkili bir şekilde birlikte iletmek için katyonik bir nanoemülsiyon geliştirdik. Nanoemülsiyonun partikül boyutu ve zeta potansiyeli, dinamik ışık saçılımı (DLS) kullanılarak belirlendi ve OVA ile kombine edilen nanoemülsiyonun sistemik ve mukozal immün yanıtları intramüsküler enjeksiyon13 ile değerlendirildi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1640 medium</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>450 nm Stop Solution for TMB Substrate</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab171529-1000 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>Countstar, China</td>
			<td>IC1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>B2064-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>5811000398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Danamic Light Scattering</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Zetasizer Nano S90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOTAP</td>
			<td>CordenPharma, Switzerland</td>
			<td>O02002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP)</td>
			<td>mabtech</td>
			<td>ab205719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>10099141C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full-function Microplate Reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>VL0000D2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG1(HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97240-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97235-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab205720-500ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat&#160;Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97245-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure homogenizer</td>
			<td>ATS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONTANE 85 PPI</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>L12910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONTANOX 80 PPI</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>36372K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVA257&#8211;264</td>
			<td>Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVA323-339</td>
			<td>Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>ZSGB-bio</td>
			<td>ZLI-9061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>R1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>retinoic acid</td>
			<td>TCI, Japan</td>
			<td>TCI-R0064-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squalene</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>S3626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T10 basic Ultra-Turrax</td>
			<td>IKA, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB ELISA Substrate</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab171523-1000ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin inhibitor</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>A003570-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Macklin, China</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>U-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cationic nanoemulsion-encapsulated retinoic acid as an adjuvant to promote ova&#45;specific systemic and mucosal responses

Katyonik nanoyapılar, dendritik hücre olgunlaşmasını, ROS oluşumunu ve antijen alımını artıran ve daha sonra antijene özgü immün yanıtları destekleyen bir adjuvan ve antijen dağıtım sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Son yıllarda, retinoik asit (RA), mukozal immün yanıtı aktive etmedeki etkisi nedeniyle artan bir ilgi görmüştür; bununla birlikte, RA'yı mukozal bir adjuvan olarak kullanmak için, çözünme, yüklenme ve verilme problemini çözmek gerekir. Burada, katyonik lipid 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DOTAP), retinoik asit, yağ fazı olarak skualen, yüzey aktif madde olarak polisorbat 80 ve yardımcı yüzey aktif madde olarak sorbitan trioleat 85'ten oluşan katyonik nanoemülsiyon kapsüllü retinoik asit (CNE-RA) dağıtım sistemini tarif ediyoruz. Fiziksel ve kimyasal özellikleri, dinamik ışık saçılımı ve bir spektrofotometre kullanılarak karakterize edildi. Farelerin antijen (ovalbümin, OVA) ve CNE-RA karışımı ile aşılanması, vajinal lavaj sıvısında ve farelerin ince bağırsak lavaj sıvısında anti-OVA salgı immünoglobulin A (sIgA) seviyelerini tek başına OVA ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde yükseltti. Bu protokol, CNE-RA'nın adjuvan etkisinin hazırlanması, karakterizasyonu ve değerlendirilmesi için ayrıntılı bir yöntemi açıklar.

Toplamda, dört nanoemülsiyon formülasyonu hazırlanmış ve Tablo 2'de sunulduğu gibi partikül boyutları (Şekil 1), zeta potansiyelleri ve kapsülleme verimlilikleri ile karakterize edilmiştir. Parçacık boyutu 160-190nm civarında konsantre edildi ve DOTAP ilavesi nanoemülsiyonun Zeta potansiyelini tersine çevirdi. OVA'ya özgü serum IgG ve serumdaki alt grup antikor düzeyi üçüncü aşılamadan 2 hafta sonra tespit edildi. Nanoemülsiyon adjuvan aşı, serum...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Development and Evaluation of a Cationic Nanoemulsion-Encapsulated Retinoic Acid System for Mucosal Vaccination at JoVE.com

Yazar Gündemi: Mukozal Aşılama için Katyonik Nanoemülsiyon Kapsüllü Retinoik Asit Sisteminin Geliştirilmesi ve Değerlendirilmesi

Bu protokolde, antijene özgü sistemik ve mukozal yanıtları desteklemek için adjuvan olarak kullanılmak üzere katyonik nanoemülsiyon kapsüllü retinoik asit (RA) geliştirdik. FDA onaylı RA'yı nanoemülsiyona ekleyerek, nanoemülsiyonun intramüsküler enjeksiyonundan sonra vajina ve ince bağırsakta antijene özgü sIgA teşvik edildi.

OVA'ya özgü sistemik ve mukozal yanıtları teşvik etmek için bir adjuvan olarak katyonik nanoemülsiyon kapsüllenmiş retinoik asit

Cationic nanostructures have emerged as an adjuvant and antigen delivery system that enhances dendritic cell maturation, ROS generation, and antigen ...

Enfeksiyon seti olarak bir bağışıklık tepkisi üreten, enfeksiyonu önleme ve bulaşmayı kesme potansiyeline sahip bir mukozal aşı üzerinde çalışıyoruz. Bu çalışmada, hem sistemik hem de mukozal immün yanıtları tetikleyen katatonik nanoemülsiyon kapsüllü retinoik asit taşıyıcı sistem intramüsküler enjeksiyon ile ovalbümin ile immünizasyon geliştirdik. Gelecekteki çalışmalarda, bağırsakla ilgili hastalıkların hayvan modelleri, aşı korumasını arttırmada katyonik nanoemülsiyon kapsüllenmiş retinoik asidin etkisini ve mekanizmasını daha fazla değerlendirmek için kullanılabilir.

cationic-nanoemulsion-encapsulated-retinoic-acid-as-an-adjuvant-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cationic Nanoemulsion-Encapsulated Retinoic Acid as an Adjuvant to Promote OVA&#45;Specific Systemic and Mucosal Responses

431 Görüntüleme.  Third Military Medical University. Enfeksiyon seti olarak bir bağışıklık tepkisi üreten, enfeksiyonu önleme ve bulaşmayı kesme potansiyeline sahip bir mukozal aşı üzerinde çalışıyoruz. Bu çalışmada, hem sistemik hem de mukozal immün yanıtları tetikleyen katatonik nanoemülsiyon kapsüllü retinoik asit taşıyıcı sistem intramüsküler enjeksiyon ile ovalbümin ile immünizasyon geliştirdik. Gelecekteki çalışmalarda, bağırsakla ilgili hastalıkların hayvan modelleri, aşı korumasını arttırmad...

Video: Yazar Gündemi: Mukozal Aşılama için Katyonik Nanoemülsiyon Kapsüllü Retinoik Asit Sisteminin Geliştirilmesi ve Değerlendirilmesi

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

Tüp bebek Patojen Kaynaklı Nötrofil Trans-epitel Göçünü Değerlendirmek için Coculture Tahlili

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; HIV Co-enfeksiyon Bağlamında Sıtma için Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Modeli

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

Experimental Infection with &lt;em&gt;Listeria monocytogenes&lt;/em&gt; as a Model for Studying Host Interferon-&amp;#947; Responses

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

Deneysel Enfeksiyon<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Ana İnterferon-γ Yanıtları incelenmesi için Bir Model Olarak

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

The small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) is a reservoir of rabies virus (RABV) in Puerto Rico and comprises over 70% of animal rabies cases reported annually. The control of RABV circulation in wildlife reservoirs is typically accomplished by a strategy of oral rabies vaccination (ORV). Currently no wildlife ORV program exists in Puerto Rico. Research into oral rabies vaccines and various bait types for mongooses has been conducted with promising results. Monitoring the success of ORV relies on estimating bait uptake by target species, which typically involves evaluating a change in RABV neutralizing antibodies (RVNA) post vaccination. This strategy may be difficult to interpret in areas with an active wildlife ORV program or in areas where RABV is enzootic and background levels of RVNA are present in reservoir species. In such situations, a biomarker incorporated with the vaccine or the bait matrix may be useful. We offered 16 captive mongooses placebo ORV baits containing ethyl-iophenoxic acid (et-IPA) in concentrations of 0.4% and 1% inside the bait and 0.14% in the external bait matrix. We also offered 12 captive mongooses ORV baits containing methyl-iophenoxic acid (me-IPA) in concentrations of 0.035%, 0.07% and 0.14% in the external bait matrix. We collected a serum sample prior to bait offering and then weekly for up to eight weeks post offering. We extracted Iophenoxic acids from sera into acetonitrile and quantified using liquid chromatography/mass spectrometry. We analyzed sera for et-IPA or me-IPA by liquid chromatography-mass spectrometry. We found adequate marking ability for at least eight and four weeks for et- and me-IPA, respectively. Both IPA derivatives could be suitable for field evaluation of ORV bait uptake in mongooses. Due to the longevity of the marker in mongoose sera, care must be taken to not confound results by using the same IPA derivative during consecutive evaluations.

Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose Herpestes Auropunctatus Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

We offered captive mongooses placebo oral rabies vaccine baits with ethyl or methyl iophenoxic acid as a biomarker and verified bait uptake using a novel liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method.

Küçük Hint firavunları (Herpestes Auropunctatus) sera bir oral kuduz aşılama biyolojik Marker olarak kullanım Için Iophenoxic asit analogları Analizi

The small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) is a reservoir of rabies virus (RABV) in Puerto Rico and comprises over 70% of animal rabies cases ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal immunity, because they can model host-pathogen interactions in the tissue. While isolated cells derived from tissues were the first cell culture model, their use has been neglected because tissue can be hard to obtain. In the present protocol, we explain how to easily process and culture tonsillar mononuclear cells (TMCs) from healthy human tonsils to study innate immune responses upon activation, mimicking viral infection in mucosal tissues. Isolation of TMCs from the tonsils is quick, because the tonsils barely have any epithelium and yield up to billions of all major immune cell types. This method allows detection of cytokine production using several techniques, including immunoassays, qPCR, microscopy, flow cytometry, etc., similar to the use of peripheral mononuclear cells (PBMCs) from blood. Furthermore, TMCs show a higher sensitivity to drug testing than PBMCs, which needs to be considered for future toxicity assays. Thus, ex vivo TMCs cultures are an easy and accessible mucosal model.

In the present protocol, we explain how to easily process and culture tonsillar mononuclear cells from healthy humans undergoing partial surgical tonsillectomy to study innate immune responses upon activation, mimicking viral infection in mucosal tissues.

Bademcikler Mononükleer Hücrelerin İzolasyon Ex Vivo Doğuştan Gelen Bağışıklık Yanıtları Bir İnsan Mukozal Lenfoid Doku Çalışma

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to assess the respiratory immune/inflammatory response to this bacterium. Flow cytometry and confocal microscopy are fluorescence-based technologies that allow detailed characterization of biological responses.&#160;Different forms of Hi antigen can be used, including cell wall components, killed/inactivated preparations, and live bacteria. Hi is a fastidious bacterium that requires enriched media but is generally easy to grow in standard laboratory settings. Tissue samples for stimulation with Hi may be obtained from peripheral blood, bronchoscopy, or resected lung (e.g., in patients undergoing surgery for the treatment of lung cancer). Macrophage and neutrophil function may be comprehensively assessed using flow cytometry with a variety of parameters measured, including phagocytosis, reactive oxygen species, and intracellular cytokine production. Lymphocyte function (e.g., T cell and NK cell function) may be specifically assessed using flow cytometry, principally for intracellular cytokine production. Hi infection is a potent inducer of extracellular trap production, both by neutrophils (NETs) and macrophages (METs). Confocal microscopy is arguably the most optimal way to assess NET and MET expression, which may also be used to assess protease activity. Lung immunity to Haemophilus influenzae can be assessed using flow cytometry and confocal microscopy.

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae induces inflammation in the respiratory tract. This article will focus on the use of flow cytometry and confocal microscopy to define immune responses by phagocytes and lymphocytes in response to this bacterium.

Haemophilus Influenzae'ye Solunum İmmün Yanıtlarının Değerlendirilmesi

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to ...

Psödotipli Virüslerle SARS-CoV-2'ye Karşı Serum Nötralizasyonunun Değerlendirilmesi

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in addition to their better-known use in gene therapy for the delivery of a gene of interest. PVs are replication defective because the viral genome is divided into different plasmids that are not incorporated into the PVs. This safe and versatile system allows the use of PVs in biosafety level 2 laboratories. Here, we present a general methodology to produce lentiviral PVs based on three plasmids as mentioned here: (1) the backbone plasmid carrying the reporter gene needed to monitor the infection; (2) the packaging plasmid carrying the genes for all the structural proteins needed to generate the PVs; (3) the envelope surface glycoprotein expression plasmid that determines virus tropism and mediates viral entry into the host cell. In this work, SARS-CoV-2 Spike is the envelope glycoprotein used for the production of non-replicative SARS-CoV-2 pseudotyped lentiviruses.
Briefly, packaging cells (HEK293T) were co-transfected with the three different plasmids using standard methods. After 48 h, the supernatant containing the PVs was harvested, filtered, and stored at -80 &#176;C. The infectivity of SARS-CoV-2 PVs was tested by studying the expression of the reporter gene (luciferase) in a target cell line 48 h after infection. The higher the value for relative luminescence units (RLUs), the higher the infection/transduction rate. Furthermore, the infectious PVs were added to the serially diluted serum samples to study the neutralization process of pseudoviruses' entry into target cells, measured as the reduction in RLU intensity: lower values corresponding to high neutralizing activity.

Yazar Spotlight: Pseudotyped Virüslerle Konak-Virüs Etkileşimlerinin İncelenmesi 

Pseudotyped viruses (PVs) are replication-defective virions that are used to study host-virus interactions under safer conditions than handling authentic viruses. Presented here is a detailed protocol that shows how SARS-CoV-2 PVs can be used to test the neutralizing ability of patients' serum after COVID-19 vaccination.

Nötralizasyon Testi Yoluyla SARS-CoV-2'ye Karşı Humoral İmmün Yanıtları İzlemek İçin Moleküler Bir Araç Olarak Psödotiplenmiş Virüsler

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...