Los autores desean agradecer a Emilie Mairey y Donnadieu Emmanuel para la instalación inicial del procedimiento.

1. Célula huésped humana y un cultivo bacteriano <ol><li> HUVECs la cultura entre el paso 1 y 9 a 37 ° en una incubadora humidificada con un 5% (v / v) de CO 2. El paso de las células cuando se acercan a 80% de confluencia con tripsina / EDTA para proporcionar el mantenimiento de las culturas 75 frascos de cultivo de 2 cm y cultivos experimentales en cámaras de flujo desechables (μ-Slides VI). </li><li> Retirar medio de los frascos que pases, se lavan las células con 10 ml de PBS, retirar y reemplazar con 1,5 ml de tripsina / EDTA. Permitir que las células de separar en un cultivo celular incubadora durante 5 minutos a 37 ° C. </li><li> Recoger las células con 10 ml de medio de cultivo celular en un tubo de 15 ml de colección. Que sedimenten las células con una centrifugación de 5 minutos (a 200 g), a temperatura ambiente. Suspender las células en 4 ml de Endo-SFM complementado con un 10% (v / v) de SFB y contar con ellos en una cámara de Malassez, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Introducir 30 l de una 1x10 6 células HUVEC por ml de suspensión en el canal (3x10 4 en total) y permitir que las células se adhieran durante 3 horas a 37 º en un incubador humidificado con una atmósfera de 5% (v / v) de CO 2. Añadir un volumen adicional de 120 l de Endo-SFM para llenar los pozos. Las células deben formar una monocapa subconfluentes (Figura 2). </li><li> Crecer N. meningitidis que expresan GFP (en este caso la cepa 8013 GFP expresa bajo el control de un promotor de IPTG-inducible), en placas de agar GCB suplementos que contienen Kellogg y 5 mg / ml de cloranfenicol a 37 ° C en una atmósfera húmeda con 5% (v / v) de CO 2 durante 16 horas. </li></ol> 2. Adhesión inicial de las bacterias individuales a las células huésped <ol><li> Ajustar la concentración de bacterias cultivadas en placas de agar GCB a un OD 600 de 0,05 con pre-calentado Endo-SFM contiene un 10% (v / v) de SFB y se incuba durante 120 minutos a 37 ° C en una atmósfera húmeda con 5% (v / v) de CO 2, bajo agitación suave (130 rpm). Inducir la expresión de GFP mediante la adición de 1 mM IPTG al medio de cultivo para el período de incubación. </li><li> Coloque el desechables μ-Slide en el escenario de un microscopio invertido equipado con una plataforma de calefacción para mantener la temperatura de la muestra a 37 ° C. </li><li> Vierta precalentado Endo-SFM suplementado con 2% (v / v) FBS en un vaso de vidrio estéril y llene una jeringa estéril de 50 ml con este medio. Coloque la &quot;entrada&quot; tubo a la jeringa y llenar con la introducción de mediano plazo. </li><li> Conecte la &quot;entrada&quot; tubo a la μ-Slide, con cuidado, con el fin de evitar la introducción de aire en la cámara. Luego, colocar la &quot;salida&quot; del tubo al otro extremo y con mucho cuidado rellenar el canal con un medio de distancia de aproximadamente 1 cm de la cámara de &quot;salida&quot;. </li><li> Medir el OD600 bacteriana y ajustarse a las 0.15 en Endo-SFM contiene un 2% (v / v) de SFB. Con el fin de observar las bacterias individuales, los agregados deben ser interrumpidos por agitación vigorosa de la muestra bacteriana. </li><li> Colocar 100 l de Endo-SFM suplementado con 2% (v / v) FBS medio en el depósito y añadir 100 ml de la solución bacteriana tomado de la parte superior de la solución de vortex para evitar cualquier toma de muestras de agregados de bacterias restantes. </li><li> Con cuidado introducir el volumen de 200 l en la μ-Slide girando la llave de paso para inyectar las bacterias en la cámara. </li><li> Introducir Endo-SFM contiene un 2% (v / v) de SFB, mantiene a 37 ° C con la plataforma de calefacción, en la cámara utilizando una bomba de jeringa con una tensión de corte compatible con la adhesión de 0.044 dinas / cm 2 durante 15 minutos. </li></ol> Véase, por vídeo o un gráfico 3 ejemplo. Después de este paso, ya sea ir a las secciones 3, 4 o 6. 3. La cuantificación de la adhesión inicial de las bacterias individuales a las células huésped <ol><li> Después de la adhesión inicial de 15 minutos, obtener imágenes de los diez campos al azar, mientras que el líquido esté todavía en circulación. </li><li> Analizar las imágenes obtenidas mediante el software ImageJ 8, con el fin de acceder a la media del número de bacterias adherant por campo. Esto se hace de la siguiente manera: en primer lugar, cada imagen es un umbral a través del &quot;umbral&quot; de la ventana se encuentra en el menú &quot;Imagen&quot; para poner de relieve la adhesión individuales bacterias fluorescentes, y reducir al mínimo el fondo de las celdas. Entonces, cada bacteria individual sea contado, utilizando el plug-in &quot;contador de células&quot; ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a> ). Los datos de cada imagen se presentan en una hoja de cálculo Excel y se promedian para cuantificar el número medio de bacterias adheridas por campo. </li></ol> 4. La medición de la resistencia al flujo de las bacterias individuales adheridas a las células huésped <ol><li> Programa de la jeringa de la bomba puesta en marcha para generar la tensión de corte que van desde 3 hasta 100 dinas / cm 2 durante 5 minutos. </li><li> Al final de los 5 minutos, adquirir diez campos elegidos al azar como se describe en el paso 3.1, pero con el flujo se detuvo prior a la adquisición. </li><li> Analizar las imágenes obtenidas como se describe en el paso 3.2 y cuantificar el número medio de bacterias que permanecen en cada campo. </li></ol> 5. Medir el crecimiento de una bacteria aislada a un adherente microcolonia <ol><li> Introducir Endo-SFM contiene un 10% (v / v) de SFB, mantiene a 37 ° C con la plataforma de calefacción, en la cámara utilizando una bomba de jeringa con la tensión de corte elegido por varias horas. Graba imágenes de microscopía de vídeo en tiempo real en un marco cada 5 minutos. </li><li> Después de la microscopía de vídeo, detener el esfuerzo cortante al desactivar la bomba de jeringa, adquirir imágenes adicionales y 2-3 y luego se detiene la secuencia de adquisición de imágenes en el software. Un ejemplo de la proliferación bacteriana se puede ver en el vídeo 2. </li></ol> 6. La medición de la resistencia al flujo de adherentes microcolonias bacterianas <ol><li> Después de la formación de microcolonias grandes en la superficie celular (step5.2) 2-3 adquirir imágenes de las dos células (por contraste de fase) y bacterias (por las buenas prácticas agrarias de fluorescencia) antes de la aplicación de flujo. Para el resto del experimento, el protocolo de adquisición del monitor sólo la fluorescencia. </li><li> La aplicación de esfuerzo cortante alto por 5 minutos (300 a 100 dinas / cm 2) y grabar imágenes en un marco cada 5 segundos. </li><li> Detener el esfuerzo cortante al desactivar la bomba de jeringa, adquirir imágenes adicionales y 2-3 y luego se detiene la secuencia de adquisición de imágenes en el software. </li><li> A continuación, retire la &quot;salida&quot; tubo de primera y con cuidado, para evitar el vaciado del canal y luego añadir pre-calentado medio fresco para llenar los pozos antes de retirar la &quot;entrada&quot; la tubería. </li><li> Para valorar el efecto del esfuerzo cortante en la resistencia bacteriana, un ensayo de recubrimiento puede llevarse a cabo de la siguiente manera: recoger el medio restante y se lava la μ-Slide dos veces con 120 l de PBS, que elimina el medio restante de la canal (ambas coladas se ) también recogió. </li><li> Separar las células infectadas con la adición de 50 l de tripsina / EDTA durante 5 minutos a 37 ° y mezclar esta muestra individual con la suspensión recogidos en el paso anterior. </li><li> Realizar diluciones seriadas en PBS y la placa de una fracción de 10 l en placas de agar GCB, por triplicado, con el fin de determinar el número de unidades formadoras de colonias (UFC) al día siguiente, después de la incubación de las placas a 37 ° C en una incubadora con 5% (v / v) de CO 2. </li></ol> Videos 3 y 4 comparan la cepa de tipo salvaje con el mutante pilV. 7. Desprendimiento de microcolonias bacterianas <ol><li> Infectar a las células en la cámara de flujo repitiendo los pasos 2.1 a 2.8 y permitir que la infección siga por 30 minutos. </li><li> Eliminar las bacterias desatado por el aumento del flujo a 10 dinas / cm 2 para un período de 2 minutos y dejar que continúe la infección durante 2 horas. </li><li> Reducir el flujo a 0,15 dinas / cm 2. </li><li> Cada hora, se recoge una gota de medio de salir de la cámara de flujo. </li><li> Realizar diluciones seriadas de las muestras y la placa que en placas de agar GCB. </li><li> Determinar el número de unidades formadoras de colonias (UFC) al día siguiente, después de la incubación de las placas a 37 ° C en una incubadora con 5% (v / v) de CO 2. </li></ol> 8. Los resultados representativos <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig1.jpg" /> Figura 1: Las diferentes etapas de una monocapa celular que puede ser observado y medido en la presencia de flujo en el procedimiento. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig2.jpg" /> Figura 2: monocapa de células endoteliales en la cámara de flujo en el inicio de un experimento (ausencia de tensión de corte). Alrededor del 50 por las células endoteliales se organizan en una sola capa sub-confluentes. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig3.jpg" /> Figura 3: Representación gráfica de la adhesión inicial de bacterias en la superficie celular. Los valores de tres campos están indicados para dar una idea de la variación del campo a campo que se espera (0044 dinas / cm 2). Video 1. Visualización de la adhesión inicial de bacterias en la monocapa celular en función del tiempo (0044 dinas / cm 2). GFP-expresando bacterias están siguiendo la dirección del medio que fluye. La película se acelera 60 veces, la duración real del video es de 10 minutos. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video1.mov">Haga clic aquí para ver el vídeo.</a> Video 2. Después de las bacterias adhesión inicial se les permitió a proliferar en la superficie celular por un período de 7 horas (acelerada 1000 veces). <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video2.mov">Haga clic aquí para ver el vídeo.</a> Video 3. Después de la proliferación en la superficie celular de la mecánicaresistencia al de microcolonias fue probado por el aumento del nivel de estrés de corte a 10 dinas / cm 2 durante 5 minutos, pero microcolonias de tipo salvaje son resistentes acelerado de 60 veces. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video3.mov">Haga clic aquí para ver el vídeo.</a> Microcolonias de vídeo 4. Formados por el mutante pilV se ven afectados por aumentar el flujo (10 dinas / cm 2). Este mutante no puede inducir a la remodelación de la membrana plasmática en microcolonias y por lo tanto más altamente sensibles al aumento del estrés de corte (video se acelera 60 veces) 5. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video4.mov">Haga clic aquí para ver el vídeo.</a>

<ol>
	<li>Mairey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+microcirculation+shear+stress+levels+determine+Neisseria+meningitidis+attachment+sites+along+the+blood-brain+barrier.">Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier.</a> J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).</li><li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+Principles+of+Vascular+Beds.">Design Principles of Vascular Beds.</a> Circ Res. 77, 1017-1023 (1995).</li><li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow.">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16, 31-42 (2009).</li><li>Tissot, O., Pierres, A., Foa, C., Delaage, M., Bongrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motion+of+cells+sedimenting+on+a+solid+surface+in+a+laminar+shear+flow.">Motion of cells sedimenting on a solid surface in a laminar shear flow.</a> Biophys J. 61, 204-215 (1992).</li><li>Mikaty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+bacterial+pathogen+induces+host+cell+surface+reorganization+to+resist+shear+stress.">Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress.</a> PLoS Pathog. 5, e1000314-e1000314 (2009).</li><li>Chamot-Rooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modification+of+pili+upon+cell+contact+triggers+N.+meningitidis+dissemination.">Posttranslational modification of pili upon cell contact triggers N. meningitidis dissemination.</a> Science. 331, 778-782 (2011).</li><li>Soyer, M., Dum&#237;nil, G., Christodoulides, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+under+shear+stress.">Bacterial adhesion under shear stress.</a> Neisseria meningitidis: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). , (2011).</li><li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+to+target+cells+enhanced+by+shear+force.">Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force.</a> Cell. 109, 913-923 (2002).</li><li>Tchesnokova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-enhanced+binding+of+intestinal+colonization+factor+antigen+I+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli.">Shear-enhanced binding of intestinal colonization factor antigen I of enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 76, 489-502 (2010).</li><li>Konto-Ghiorghi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+for+pilus+in+adherence+to+epithelial+cells+and+biofilm+formation+in+Streptococcus+agalactiae.">Dual role for pilus in adherence to epithelial cells and biofilm formation in Streptococcus agalactiae.</a> PLoS Pathog. 5, e1000422-e1000422 (2009).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La importancia del esfuerzo de corte y en general de los aspectos mecánicos en la biología es cada vez más reconocida. Por ejemplo, las propiedades altamente adaptados adhesiva de la familia de las selectinas de las proteínas en el proceso de adhesión de linfocitos y rodar sobre la pared vascular ha sido reconocida por la introducción de esfuerzo cortante en el proceso. El procedimiento descrito anteriormente se aplicó a las bacterias Gram-negativas Neisseria meningitidis, pero debe ser aplicable a una amplia gama de agentes patógenos. La importancia del esfuerzo de corte se ha demostrado también por otros agentes patógenos y otros sitios de infección. La adhesión bacteriana condicionada por el esfuerzo cortante ha sido descrito por el estudio de la adhesina FimH encuentra en uropatógena Escherichia coli (UPEC) 9. Similar a las selectinas, la interacción entre FimH y su receptor de la célula huésped se demostró que era reforzada por corte inducido por fuerzas mecánicas 9 y la adhesina de E. coli enterotoxigénica de CFAE ha informado también a la mediación de la adhesión a células epiteliales intestinales a través de un corte que dependen de mecanismo 10. Nos informó, a través del protocolo de cámara de flujo laminar ensayo descrito en este capítulo que Streptococcus agalactiae pili eran esenciales para el cumplimiento de este patógeno a las células epiteliales en condiciones de flujo 11. Estos estudios confirman que nuestro ensayo cámara de flujo es una herramienta útil para la investigación de la célula huésped-patógeno interacciones en condiciones de esfuerzo cortante.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> μ-Slide VI 0.4 kit de flujo </td><td> Ibidi </td><td> 80606 </td></tr><tr><td> Plastipak jeringa de 50 ml Luer-Lock </td><td> Becton Dickinson </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> Tubos Tygon R3603 3,2 x 4,8 mm </td><td> Fisher-Científico </td><td> R3603 </td></tr><tr><td> Llave de 3 vías, 2 luer hembra a macho luer </td><td> Bio-Rad </td><td> 7328103 </td></tr><tr><td> Jeringa de la bomba </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PHD 2000 </td></tr><tr><td> Microscopio invertido, Nikon </td><td> Nikon </td><td> Eclipse T i </td></tr><tr><td> CCD de la cámara </td><td> Hamamatsu </td><td> ORCA 285 CCD o ORCA 3-CCD </td></tr><tr><td> ImageJ software </td><td> NIH </td><td> Freeware ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) </td></tr></tbody></table>

introducing shear stress in the study of bacterial adhesion

Durante las infecciones bacterianas de una secuencia de interacciones se producen entre el patógeno y su huésped. La adhesión bacteriana a la superficie de la célula huésped es a menudo el paso inicial y determinante de la patogénesis. Aunque experimentalmente adherencia es en su mayoría estudiaron en condiciones estáticas de adhesión en realidad se lleva a cabo en presencia de flujo de líquido. Los primeros encuentros entre la bacteria y su huésped a menudo se producen a nivel de mucosas, boca, pulmones, intestinos, ojos, etc, donde el moco fluye a lo largo de la superficie de las células epiteliales. Después de la infección, los patógenos en ocasiones acceder a la circulación de la sangre que causan enfermedades graves como sepsis septicemia y meningitis. Un rasgo característico de estas infecciones es la capacidad de estos patógenos para interactuar con las células endoteliales en presencia de la sangre circulante. La presencia de flujo de líquido, moco o sangre, por ejemplo, determina la adhesión, ya que genera una fuerza mecánica sobre el patógeno. Para caracterizar el efecto del flujo de un líquido por lo general se refiere a la noción de esfuerzo cortante, que es la fuerza tangencial ejercida por unidad de superficie por un fluido en movimiento cerca de una pared fija, expresada en dinas / cm 2. Intensidades de esfuerzo cortante varían mucho según el tipo de embarcaciones diferentes, el tamaño, el órgano, ubicación, etc (000 a 100 dinas / cm 2). La circulación en los capilares puede alcanzar valores de corte muy bajo estrés e incluso detener temporalmente durante los períodos que oscilan entre unos pocos segundos hasta varios minutos 1. En el otro extremo del espectro de la tensión de corte en las arteriolas pueden alcanzar los 100 dinas / cm 2 2. El impacto de la tensión de corte en diferentes procesos biológicos se ha demostrado claramente, como por ejemplo durante la interacción de los leucocitos con el endotelio 3. Para tener en cuenta este parámetro mecánico en el proceso de adhesión bacteriana que se aprovechó de un procedimiento experimental basado en el uso de un flujo de 4 cámaras desechables. Las células hospedadoras se cultivan en la cámara de flujo y bacterias fluorescentes se introducen en el flujo controlado por una bomba de jeringa. Inicialmente se centró nuestras investigaciones sobre la bacteria patógena Neisseria meningitidis, una bacteria Gram-negativo responsable de la septicemia y la meningitis. El procedimiento descrito aquí nos ha permitido estudiar el impacto del esfuerzo cortante en la capacidad de las bacterias a: adherirse a las células 1, que proliferan en la superficie celular y 5 para separar a colonizar nuevos sitios 6 (Figura 1). Información técnica complementaria se puede consultar la referencia 7. Los valores de esfuerzo de corte presentados aquí fueron elegidos en base a nuestra experiencia previa y una para representar los valores encontrados en la literatura. El protocolo debe ser aplicable a una amplia gama de agentes patógenos con ajustes específicos en función de los objetivos del estudio.

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Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Durante el proceso de infección, un paso clave es la adhesión de los patógenos con las células huésped. En la mayoría de los casos este paso la adhesión se produce en presencia de la tensión mecánica generada por el flujo de líquidos. Se describe una técnica que presenta el esfuerzo cortante como un parámetro importante en el estudio de la adhesión bacteriana.

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.5K vistas.  INSERM U970. Durante el proceso de infección, un paso clave es la adhesión de los patógenos con las células huésped. En la mayoría de los casos este paso la adhesión se produce en presencia de la tensión mecánica generada por el flujo de líquidos. Se describe una técnica que presenta el esfuerzo cortante como un parámetro importante en el estudio de la adhesión bacteriana.

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In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

Ensayo in vitro de la adhesión bacteriana a las células epiteliales de mamíferos

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Investigación

Inmunología e Infección

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

Humanizado modelo de ratón para el Estudio de Infecciones Bacterianas Targeting la microvasculatura

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Un ensayo de adhesión de flujo para estudiar Leucocyte Reclutamiento para hepático humano sinusoidales endotelio en condiciones de estrés de cizalla

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

Ensayo de adherencia estática para el Estudio de la integrina activación en linfocitos T

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generación y multi-fenotípicos cribado de alto contenido de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; transposón mutantes

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro e in vivo modelo para estudiar la adhesión bacteriana a la pared del recipiente en condiciones de flujo

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

Métodos para inhibir bacteriana Pyomelanin Producción y determinar el correspondiente aumento en la sensibilidad al estrés oxidativo

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Ensayo de adhesión en condiciones de estrés de cizalla para el Estudio de linfocitos T-molécula de adhesión Interacciones

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin acquisition at the bacterial cell surface plays in resistance to the host immune system. Flow cytometry experiments identified human plasma vitronectin as a ligand for the bacterial receptor outer membrane protein H of Haemophilus influenzae type f. An enzyme-linked immunosorbent assay was employed to characterize the protein-protein interactions between purified recombinant protein H and vitronectin, and binding affinity was assessed using bio-layer interferometry. The biological importance of the binding of vitronectin to protein H at the bacterial cell surface in evasion of the host immune response was confirmed using a serum resistance assay with normal and vitronectin-depleted human serum. The importance of vitronectin in bacterial adherence was analyzed using glass slides with and without vitronectin coating, followed by Gram staining. Finally, bacterial adhesion to human alveolar epithelial cell monolayers was investigated. The protocols described here can be easily adapted to the study of any bacterial species of interest.

This report describes protocols for characterizing interactions between bacterial outer membrane proteins and the human complement regulator vitronectin. The protocols can be used to study the binding reactions and biological function of vitronectin in any bacterial species.

Ensayos para estudiar el rol de vitronectina en la adhesión bacteriana y resistencia de suero

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of infected cells, including organelle ultrastructure, cytoskeletal network organization, as well as cellular processes such as Stress Granule (SG) formation. The characterization of how pathogens subvert host processes is an important and integral part of the field of pathogenesis. While variable phenotypes may be readily visible, the precise analysis of the qualitative and quantitative differences in the cellular structures induced by pathogen challenge is essential for defining statistically significant differences between experimental and control samples. SG formation is an evolutionarily conserved stress response that leads to antiviral responses and has long been investigated using viral infections1. SG formation also affects signaling cascades and may have other still unknown consequences2. The characterization of this stress response to pathogens other than viruses, such as bacterial pathogens, is currently an emerging area of research3. For now, quantitative and qualitative analysis of SG formation is not yet routinely used, even in the viral systems. Here we describe a simple method for inducing and characterizing SG formation in uninfected cells and in cells infected with a cytosolic bacterial pathogen, which affects the formation of SGs in response to various exogenous stresses. Analysis of SG formation and composition is achieved by using a number of different SG markers and the spot detector plug-in of ICY, an open source image analysis tool.

We describe a method for the qualitative and quantitative analysis of stress granule formation in mammalian cells after the cells are challenged with bacteria and a number of different stresses. This protocol can be applied to investigate the cellular stress granule response in a wide range of host-bacterial interactions.

Análisis de inmunofluorescencia de la formación de gránulos de estrés tras el desafío bacteriano de las células de mamíferos

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...