La formación de procoagulantes plaquetarios es crucial para mantener la hemostasia. Este proceso implica la expresión de fosfolípidos y la liberación de microvesículas en la superficie de las plaquetas, que es esencial para los pasos de coagulación. Las evaluaciones de este proceso han proporcionado nuevos datos sobre cómo son las respuestas procoagulantes plaquetarias en diversas enfermedades humanas.
La citometría de flujo ha sido una piedra angular y ha ganado una amplia aceptación en la evaluación de la expresión de fosfatidilserina en plaquetas y la liberación de microvesículas. El aislamiento y el análisis de las plaquetas purificadas de la sangre requieren mucho tiempo y equipos de laboratorio especializados, por lo que actualmente no están disponibles para el diagnóstico clínico de rutina. El análisis de la exposición a la fosfatidilserina y la liberación de microvesículas también es un desafío debido a su pequeño tamaño y al bajo número de eventos positivos para los marcadores de interés.
Para empezar, recoja sangre venosa periférica en tubos de recolección que contengan el anticoagulante activo citrato trisódico con ácido cítrico y dextrosa. Invierta suavemente el tubo para mezclar la sangre con el anticoagulante y deje reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos. Cuente las plaquetas utilizando un contador de células automatizado para determinar la velocidad correcta de centrifugación.
Para preparar el plasma rico en plaquetas, centrifugar la sangre a 250 g durante 10 minutos a temperatura ambiente sin aplicar el descanso. A continuación, añadir 1 mililitro de ACDA y 6,25 microlitros de apirasa a 9 mililitros de plasma rico en plaquetas. Centrifugar la mezcla a 1,100 g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Con una pipeta de pasto, retire el sobrenadante que contiene plasma pobre en plaquetas y vuelva a suspender suavemente el pellet de plaquetas en 1 mililitro de tampón de lavado. A continuación, añada de 3 a 4 mililitros de tampón de lavado al tubo y vuelva a centrifugarlo. Después de eliminar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 1 mililitro de tampón de lavado.
Transfiera 150 microlitros de la suspensión de plaquetas a un tubo de 1,5 mililitros para contar las células en un contador de células automatizado. Agregue de 3 a 4 mililitros de tampón de lavado a la suspensión restante para realizar un lavado adicional como se demostró anteriormente. A continuación, vuelva a suspender el pellet de plaquetas en el tampón de reacción para lograr una concentración final de 5 x 10 a la potencia de 11 plaquetas por litro.
Para empezar, obtenga las plaquetas lavadas en el tampón deseado para la citometría de flujo. Prepare todos los agonistas y fluorocromos en el tampón de reacción. Para los ensayos internos, añadir 100 microlitros de plaquetas lavadas a una concentración de 50 x 10 a la potencia de 9 plaquetas por litro a diferentes tubos de tratamiento.
Agite suavemente cada alícuota e incube a 37 grados centígrados durante 5 minutos. A continuación, añada 5 microlitros de anexina V-FITC no diluida a cada microtubo e incube. Después, añade 500 microlitros de tampón de reacción a cada tubo para detener el proceso.
Controle la población de plaquetas utilizando dispersión directa o FSC y utilice gráficos de densidad para identificar cada población de forma independiente. Establezca el punto de corte negativo en el extremo derecho de la población de plaquetas del estado en reposo. Después de la activación, clasifique los eventos a la derecha de este punto de corte como plaquetas que exponen fosfatidilserina.
Para diferenciar las microvesículas, establezca el punto de corte en el valor más bajo de FSC observado en la población de plaquetas en reposo. Después de la activación, clasifique los eventos positivos de fosfatidilserina por debajo de este umbral como microvesículas. Las mediciones iniciales indicaron que menos del 2,9% de las plaquetas no activadas exhibieron exposición a fosfatidilserina.
Tras la activación, el 26,7% de las plaquetas se convirtieron en fosfatidilserina positiva con colágeno, el 9,1% con trombina y el 36,2% con colágeno y trombina. El tratamiento con ionóforos dio como resultado un 49,6% de plaquetas positivas para fosfatidilserina. La proporción basal de microvesículas fue del 0,3%Se observaron aumentos significativos solo con el colágeno y la trombina juntos, en torno al 11,4%, y más aún con los ionóforos, en el 44%
