El objetivo de esta investigación es evaluar la función plaquetaria en condiciones fisiológicas. Estudiamos específicamente la función plaquetaria utilizando dispositivos microfluídicos y superficies biológicas. Y utilizando este enfoque, pudimos responder a preguntas relacionadas con la disfunción plaquetaria y la reanimación hemostática para aplicaciones en medicina transfusional.
Los ensayos actuales de la función plaquetaria a menudo prueban la capacidad de las plaquetas para agregarse en respuesta a un agonista específico de elección. Los métodos de detección pueden incluir la transmisión de luz o la impedancia eléctrica, y estos ensayos pueden utilizar muestras de proceso y se prueban de forma estancada. Mediante el uso de este enfoque microfluídico para evaluar la función plaquetaria, incorporamos la dinámica de fluidos para agregar relevancia fisiológica.
La dinámica de fluidos juega un papel crítico en los mecanismos biológicos involucrados en la función plaquetaria durante la hemostasia. En los pacientes con hemorragias, estamos particularmente preocupados por la función plaquetaria y las intervenciones terapéuticas que pueden mejorar esa función para obtener mejores resultados. Con este enfoque de prueba de la función plaquetaria, podemos rastrear las contribuciones de diferentes poblaciones de plaquetas en un experimento y desbloquear una forma de evaluar las opciones terapéuticas para el trauma y otras afecciones hemorrágicas.
Para empezar, vierta la base de elastómero de silicona en un plato de pesaje. Agregue el agente de curado de silicona en una proporción de diez a uno y revuelva bien la mezcla para garantizar la reticulación adecuada de las cadenas de polímero de silicona. Coloque el molde maestro en una placa de Petri y vierta el PDMS sin curar en el molde de manera uniforme.
Luego, coloque la placa de Petri dentro de un desecador al vacío durante 30 minutos para eliminar las burbujas de la mezcla. Para terminar de curar el PDMS, coloque el molde en un horno a 70 grados centígrados durante 90 minutos. Después de completar el curado de PDMS, use una hoja de afeitar o un bisturí para cortar el yeso microfluídico.
Perfora agujeros en los bordes de los canales. Ahora, coloque el portaobjetos de vidrio y el molde microfluídico con el lado grabado hacia arriba en un limpiador de plasma. Encienda la bomba de vacío y selle la cámara.
Luego, encienda el limpiador de plasma a la configuración alta y deje la configuración en el limpiador durante 30 segundos. Después de eso, apague el limpiador de plasma y suelte la aspiradora. Para unir el portaobjetos de vidrio y fundición limpiados con plasma, presione suavemente los lados que estaban hacia arriba en el limpiador de plasma.
Coloque el dispositivo microfluídico en un horno o en una placa caliente a 70 grados centígrados durante 10 minutos para finalizar el proceso de unión. Ahora, cubra la cámara microfluídica con reactivo de colágeno fibrilar equino tipo uno a través de una salida designada a la entrada designada. Guarde el dispositivo en un recipiente cálido, húmedo y cerrado para evitar que el colágeno recubierto se evapore dentro del canal.
Después de una hora, enjuague el dispositivo con PBS en la dirección opuesta al recubrimiento para eliminar la solución de colágeno. Para empezar, incube la sangre entera citrato con un anticuerpo CD41 conjugado en fluorescencia, utilizando un fluoróforo de su elección. Tiñe la sangre durante 30 minutos en un balancín nutante.
A continuación, encienda el microscopio y el software asociado. Ajuste el nivel de la bomba de jeringa de extracción con la platina del microscopio y ajuste la configuración de la bomba de jeringa de acuerdo con los requisitos experimentales. Luego, coloque el dispositivo microfluídico en la platina del microscopio y pegue sus bordes a la platina para evitar el movimiento.
Ahora, conecte el tubo de un dieciseisavo de pulgada de diámetro interno a un conector de codo y luego a una jeringa de 10 mililitros con un conector de un dieciseisavo de pulgada de diámetro interno. Llene la jeringa de 10 mililitros con PBS estéril y conéctela a la bomba de jeringa. Luego, inserte el conector de codo en la salida del dispositivo microfluídico.
Prepare las líneas de entrada de aproximadamente 10 centímetros de largo con un conector de codo en un extremo y un corte en ángulo en el otro extremo. Ahora, conecte el conector del codo de entrada a la entrada del dispositivo y coloque la línea de entrada en un tubo de microcentrífuga residual colocado en un soporte en ángulo. Utilice la lente del objetivo de 10 aumentos para enfocar los bordes del canal del dispositivo microfluídico.
A continuación, cebe las líneas con PBS. Haga avanzar manualmente la bomba de jeringa para limpiar el canal de cualquier PDMS o desechos. Revise cerca de la entrada y salida del canal para ver si hay obstrucciones.
Ahora, abra la configuración de captura de imágenes guardadas o cree un nuevo procedimiento de captura de imágenes para imágenes de series temporales capturadas cada uno o dos segundos con un canal de campo claro y canales fluorescentes correspondientes a los anticuerpos CD41 en la muestra de sangre. Obtén la muestra de sangre citrada filtrada y mézclala pipeteando hacia arriba y hacia abajo justo antes de comenzar el experimento. Coloque la muestra en el soporte de microcentrífuga en ángulo.
Luego, coloque la línea de entrada en la muestra de sangre y comience a registrar la captura de la imagen. Retire lentamente la jeringa para llenar el volumen muerto en el tubo. Una vez que la sangre llegue al canal, presione inmediatamente Play en la bomba de jeringa para reanudar el flujo a la velocidad pura deseada.
Ejecute el experimento hasta que las plaquetas hayan ocluido completamente la región estenótica del dispositivo microfluídico, o hasta el punto final experimental, que suele ser de 10 minutos. Una vez finalizado el experimento, detenga la captura de la imagen y detenga la bomba de la jeringa. Finalmente, guarde la captura de la imagen en el almacenamiento adecuado.
