Nuestra investigación se centra principalmente en los mecanismos de recepción al frío de los juveniles de tercera etapa de dispersión del nematodo de la madera del pino, abordando específicamente cómo el nematodo de la madera del pino soporta el estrés a baja temperatura a aproximadamente menos 20. El desafío experimental actual es el tiempo de deshidratación, que es crítico para determinar la tasa de supervivencia de los juveniles de dispersión de tercera etapa de Bursaphelenchus xylophilus. Aconsejamos que cuanto más largo sea el tiempo, mejor será el énfasis.
Hemos establecido que la entrada de juveniles de dispersión de tercera etapa de Bursaphelenchus xylophilus en criptobiosis les permite soportar ambientes de temperaturas extremadamente bajas, lo que destaca un mecanismo de supervivencia clave en condiciones adversas. Nuestro protocolo aborda la brecha de investigación al inducir la criptobiosis en nematodos de la madera de pino y revivirlos arquitectónicamente con éxito. Permite estudios controlados de sus mecanismos de supervivencia y aplicaciones adicionales.
Nuestro protocolo es simple y confiable para un soporte técnico muy robusto para mantener los mecanismos de resistencia a la tensión del nematodo de la madera del pino, lo que lo hace más accesible y eficiente en comparación con otras técnicas. Comience cortando los troncos redondos recolectados de Pinus massoniana en rodajas de 0,5 a un centímetro de grosor con una sierra. Recorta las rodajas en tiras pequeñas de dos a tres centímetros de largo.
Coloque las pequeñas tiras de madera en bolsas selladas y guárdelas en un laboratorio para su uso posterior. Conecte un tubo de goma al extremo estrecho de un embudo de vidrio de cuello largo con un diámetro aproximado de 15 centímetros. Asegure el tubo de goma con una llave de presión y coloque el embudo ensamblado en un soporte de embudo.
Envuelva completamente las pequeñas tiras de madera en una sola capa de papel de seda. Coloque las tiras de madera envueltas en el embudo y agregue agua destilada hasta que todas las tiras de madera estén sumergidas, luego suelte lentamente la llave de presión en la parte inferior del embudo y permita que de 2000 a 5,000 microlitros de la mezcla se filtren en una placa de Petri de cinco centímetros de diámetro para el examen microscópico y la identificación morfológica. Observe la mezcla para identificar J3 Bursaphelenchus xylophilus al notar características como estiletes, bulbos esofágicos medianos, gotas de lípidos y formas de cola en forma de dedos.
Con una pipeta de 10 microlitros, aspire 10 microlitros de líquido junto con un nematodo cada vez para transferir el ejemplar J3 individual de Bursaphelenchus xylophilus a un portaobjetos. Finalmente, esterilice las tiras de madera restantes y los materiales de madera infectados después de extraer J3 Bursaphelenchus xylophilus para evitar una mayor contaminación. Para comenzar, extraiga muestras de J3 Bursaphelenchus xylophilus de Pinus massoniana, luego prepare una solución acuosa de cloruro de potasio al 8% para la regulación osmótica.
Con una pipeta, agregue 10 microlitros de la solución acuosa de cloruro de potasio al 8% al portaobjetos que contiene la mezcla de J3 Bursaphelenchus xylophilus. Coloque el portaobjetos en la platina del microscopio y permita que el agua se evapore de forma natural. Observe el proceso de deshidratación de J3 Bursaphelenchus xylophilus bajo el microscopio.
Vigile los signos, como el enroscamiento y la agregación del cuerpo. Cuando el agua se evapora por completo y los cristales de cloruro de potasio precipitan, observe que los nematodos detienen su movimiento y entran en criptobiosis. Coloque el criptobiótico J3 Bursaphelenchus xylophilus en un ambiente de temperatura constante de menos 20 grados Celsius durante 24 horas.
Después de 24 horas, use una pipeta para agregar aproximadamente 300 microlitros de agua destilada alrededor de los juveniles que se sometieron a un tratamiento a baja temperatura. Observe el proceso de rehidratación de J3 Bursaphelenchus xylophilus bajo el microscopio. Vigile signos como el estiramiento del cuerpo y la reanudación del movimiento.
