Nos gustaría dar las gracias a Thomas Lecuit (sqh-line Utrofina :: GFP), la Bolsa de Centro de Bloomington y el hibridoma Estudios del Desarrollo del Banco para los reactivos. Agradecemos además a todos los miembros del Laboratorio Tootle útil para los debates y las críticas del manuscrito. La financiación de la National Science Foundation fondos iniciales de la anatomía y el Departamento de Biología Celular MCB-1158527, y de la Universidad de Iowa apoya este trabajo. Institutos Nacionales de la Salud Predoctorales de Formación Grant en Farmacológica Ciencias T32GM067795 apoyaron AJS. Soporte de almacenamiento de datos fue proporcionada por la ICTS, que se financia a través de la CTSA apoyado por el Centro Nacional para Recursos de Investigación y el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias de traslación, Institutos Nacionales de Salud, a través de Grant UL1RR024979.

1. Preparación de Drosophila Antes de la etapa de aislamiento <ol><li> Hacer pasta de levadura húmeda combinando 50 g de levadura seca activa con 90 ml de agua destilada. Mezclar con una espátula para mezclar. Dejar reposar la mezcla durante aproximadamente 30 minutos antes de la evaluación de la consistencia. La consistencia debe ser sólo lo suficientemente gruesa como para adherirse a la parte de un vial mosca pero no correr por el lado. Para lograr la consistencia deseada puede ser necesario añadir un máximo de 10 ml de agua adicional o una pequeña cantidad de levadura seca. Almacene en un recipiente tapado a 4 ° C. La levadura almacenada se puede utilizar para ~ 1-2 semanas. </li><li> Reunir &lt;24 hr viejas moscas adultas (hombres y mujeres) de los genotipos deseados y los puso en un vial con comida fly plus pasta de levadura húmeda untado en el lado del vial. La temperatura a la que se mantienen las moscas variará dependiendo del experimento. Para los experimentos de rutina, las moscas se mantuvieron a temperatura ambiente. Considerando que experimentos en los que un gen seestá sobreexpresada usando el sistema de UAS/GAL4 15 de mayo requerir el mantenimiento de las moscas a 25 ° C o superior, según sea apropiado. </li><li> Proporcionar a las moscas con un frotis fresco de pasta de levadura al día durante 2 días. NOTA: A medida que el desarrollo del folículo está estrechamente regulada por el estado nutricional de la mosca hembra, es indispensable proporcionar a la mosca con la rica pasta de levadura de nutrientes durante al menos 36 horas antes de la disección. </li></ol> 2. Aislar a mediados y finales de Staged Drosophila folículos <ol><li> Permita que el medio para llegar a la temperatura ambiente (~ 30 min). Si los folículos por etapas van a ser utilizados para los ensayos in vitro de desarrollo en recién preparar medios IVEM (medios de Grace de insectos, 10% de suero bovino fetal inactivado por calor, y 1x penicilina / estreptomicina). Si los folículos por etapas van a ser utilizados para el ARNm o el aislamiento de proteínas usan ya sea de insectos de Grace o medios IVEM. IMPORTANTE: Temperatura del fluido es crítico. Si el medio es el frío que se alteratanto la actina y microtúbulos citoesqueletos y desarrollo del bloque. </li><li> Anestesie las moscas en el vial yeasted mediante la inyección de CO 2 gas y colocar 3-5 moscas hembra en una almohadilla de mosca bajo CO 2. IMPORTANTE: No deje más hembras que pueden ser diseccionado en un período de tiempo de 10 min en la plataforma de la mosca como la exposición prolongada a CO 2 pueden causar esterilidad y la muerte. </li><li> Llenar un pocillo de una placa de 9-punto con los medios de comunicación y colóquelo en la parte superior de una superficie oscura (un pedazo de plexiglás negro funciona bien). Enfoque el microscopio de disección en la parte inferior del pozo. </li><li> Uso # 5 pinzas Dumont recoger una sola hembra con una mano (esto se hace mejor con la mano dominante). A menudo es más fácil de recoger a la hembra por las alas, piernas o tórax a la transición abdomen. Sumerja la mujer en los medios de comunicación llenos también. Ajuste el enfoque del microscopio según sea necesario. </li><li> El uso de un segundo par de pinzas en la mano no dominante, agarra a la hembra en el extremo anterior del abdomende manera que el extremo posterior está posicionado hacia la mano dominante (Figura 2A). Asegúrese de mantener la marcha sumergido en los medios de comunicación. </li><li> Con la mano dominante, utilizar las pinzas para agarrar la cutícula en el segundo segmento pigmentada más posterior y rasgar lejos del resto del abdomen (Figuras 2B-C). </li><li> Usando las pinzas en la mano dominante, apriete suavemente el extremo anterior del abdomen hasta que los ovarios emergen (Figuras 2D-E). Si es necesario, coloque la pinza entre los dos ovarios y sacarlos de la canal. </li><li> Mueva los ovarios para que un nuevo pozo con medio fresco (Figura 2F) o retire el cadáver de una toalla Kimwipe o papel. Esto es particularmente importante si los folículos se están aislados para el desarrollo in vitro. </li><li> Repita hasta que se han aislado de 3-5 pares de ovarios. NOTA: Cada ovario se compone de ~ 16 ovarioles o cadenas de forma secuencial con vencimiento folículos. Cada ovarioleestá contenido dentro de una vaina del músculo. </li><li> El uso de prensas de patas y las agujas suministradas con ellos, tire suavemente aparte del ovario mediante la ejecución de las agujas entre los ovarioles (Figura 2 G). Esto a veces liberar los folículos individuales también. </li><li> Ovarioles individuales y las etapas morfológicas fácilmente distinguibles de desarrollo del folículo ahora debe ser visible (Figura 2G, se separan del ovario). Consulte las Figuras 1 y 2H de las diferencias morfológicas que se pueden utilizar para distinguir las diferentes etapas. Para aislar folículos que están dentro de ovariolas intactas y todavía contenidos dentro de una vaina del músculo, utilizar una aguja para cortar a través de la ovariole en la parte anterior del folículo anterior y en la posterior de la folículo inmediatamente después de la folículo de interés. Esto romperá la vaina del músculo y el folículo de interés lejos ahora se puede cortar lejos de los folículos vecinos sin dañarlo. </li&gt; <li> A medida que se separan las fases individuales, mover los folículos de interés, utilizando una pipeta de vidrio, a un nuevo pozo con medio fresco. Esto es particularmente importante cuando el aislamiento de folículos para el desarrollo in vitro. NOTA: Es importante para exprimir el bulbo de la pipeta antes de entrar en los medios de comunicación para evitar las burbujas de aire de la redistribución de los folículos de interés a lo largo del pozo. Además, si los folículos están pegando a la pipeta de vidrio, la pipeta puede reviste previamente con 3% de albúmina de suero bovino (BSA) pipeteando la solución de BSA arriba y abajo varias veces y enjuague con medios de disección. </li><li> Una vez que suficientes folículos se han aislado, continuar con los experimentos posteriores. </li></ol> 3. Desarrollo in vitro de folículos S10B <ol><li> Aislar folículos S10B usando el protocolo de aislamiento de fase (paso 2) en los medios de comunicación IVEM. Asegúrese de que los folículos se mueven rápidamente lejos de los escombros. A medida que estos folículos continuarán madurando, es importante que S10Bs se recogen durante 30-60 minutos y luego se coloca en los medios de comunicación de maduración de elección. NOTA: S10B deben distinguirse cuidadosamente de folículos S10A (Figura 1C comparación con 1B), como folículos S10A no madurarán en los medios de cultivo IVEM. En tanto S10A y S10B folículos, la mitad de la longitud se compone de células de la enfermera y la otra mitad es el ovocito, pero en S10B la longitud del folículo es igual a la de los folículos S14. </li><li> Usando una pipeta de vidrio, mover ~ 30 folículos S10B en un pocillo de una placa de cultivo tisular de 24 pocillos. NOTA: Asegúrese de verificar que todos los folículos que se transfieren son S10B y no han madurado hasta S11. </li><li> Preparar 1 l de media maduración por pozo, es decir, los medios de comunicación IVEM más reactivos farmacológicos. </li><li> Usando una pipeta de vidrio tirado *, eliminar la mayor cantidad de medios desde el pozo (paso 3.2) como sea posible, y rápidamente agregar medios maduración de elección. NOTA: Es imprescindible el uso de un pip vidrio tiradoette como folículos por etapas puede ser fácilmente absorbido tanto con pipetas de vidrio o puntas de pipeta con una Pipetman. * Para hacer pipetas tirados: 1) calentar la parte delgada de largo, pipetas de vidrio en la llama de un mechero Bunsen sólo hasta que el cristal comienza a ablandarse, 2) pasar de inmediato la pipeta de la llama y tire horizontalmente para dibujar la pipeta en un tubo fino, 3) romper para generar un punto fino. PRECAUCIÓN: Use protección para los ojos como fragmentos de vidrio pueden volar. </li><li> Repita los pasos 3.1 a 3.4 para tantos pozos como el experimento requiere. </li><li> Permitir a los folículos a desarrollar durante&gt; 10 h, y la puntuación de la progresión en el desarrollo bajo un microscopio de disección. NOTA: Los experimentos suelen ser marcados al día siguiente para dar tiempo suficiente para que los folículos se desarrollen. S10B es de ~ 5 horas, S11 es de ~ 30 min, S12 es de ~ 2 h, y S13 es de ~ 1 hora de duración a 25 ° C 1 y desarrollo a temperatura ambiente tardará un poco más. Experimentos similares al descrito para los folículos pueden ser S10Brealizado utilizando folículos S11-S13. </li></ol> 4. Etapa Aislamientos para imágenes en vivo <ol><li> Aislar los folículos en fase tardía (S10B-14) que expresa el marcador fluorescente de elección mediante el protocolo de aislamiento etapa (etapa 2) en los medios de comunicación IVEM, moviéndose rápidamente folículos lejos de los escombros. </li><li> Mueva los folículos de interés en nuevos medios de comunicación y luego transferir mediante una pipeta de vidrio a una placa de Petri de fondo cubreobjetos. Tenga cuidado al añadir los medios para que las burbujas en la zona del fondo cubreobjetos pero no se derrame sobre. </li><li> Para películas a intervalos más largos, a veces es necesario para mantener la humedad dentro de la placa de Petri mediante la adición de un enrollado Kimwipe, humedecido con agua, hasta el borde interior de la placa de Petri. Coloque la tapa en la parte superior. </li><li> Imagen de un microscopio invertido. Resolución detallada requerirá la microscopía confocal. Es necesario para equilibrar la frecuencia de formación de imágenes, la fuerza de la iluminación, y la longitud de proyección de imagen; este tendrá que ser trabajado de forma independiente para cada Lherramienta Abeling y el proceso de desarrollo. </li></ol> 5. Etapa de aislamiento para la Preparación de ARNm <ol><li> Aislar folículos individuales de cada etapa usando el protocolo de aislamiento de fase (paso 2) con cualquiera de los medios de Grace o IVEM. </li><li> Usando una pipeta de vidrio, mover las etapas individuales de interés en nuevos pozos con medios de comunicación, sino que es posible recoger múltiples etapas a la vez. </li><li> Mantenga horarios de recogida en el punto 1 hr. Mover los folículos, usando una pipeta de vidrio, a 1,5 ml de tubos de microfuga. </li><li> Haga girar el tubo brevemente en un mini-microcentrífuga para sedimentar todos los folículos. Usando una pipeta de vidrio tirado (véase el paso 3.4) retire con cuidado todos los medios de comunicación. NOTA: Si utiliza una microcentrífuga a tamaño completo, centrifugar los folículos a baja velocidad. </li><li> Añadir 100 l de Trizol y moler a mano durante ~ 20 s utilizando un mortero plástico. Haga girar hacia abajo a toda velocidad en una microcentrífuga y mover Trizol a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con cuidado de no tocar ninguna d peletizadoebris. Almacenar a -80 ° C. </li><li> Repita los pasos 5.1 a 5.5 hasta que haya suficientes folículos se han obtenido para el experimento. Rutinariamente, ~ 75 S10B, ~ 75 S12, y S14 ~ 100 ~ folículos dió 10 g de ARN. </li><li> Descongele las muestras en hielo. Combine las muestras, según el caso, en un tubo de microcentrífuga y llevar el volumen Trizol hasta 800 l. Proceda con el aislamiento de ARN como lo indique el fabricante. IMPORTANTE: Recuerde que debe tratar la DNasa ARN aislado con RNasa libre de DNasa. </li></ol> 6. Etapa de aislamiento para el Western Blot <ol><li> Precaliente un bloque de calor a 100 ° C. </li><li> Aislar folículos individuales de cada etapa usando el protocolo de aislamiento de fase (paso 2) con cualquiera de los medios de Grace o IVEM. NOTA: Es necesario determinar empíricamente la cantidad de un folículo etapa particular se necesitan para observar cada proteína específica. Para las proteínas altamente expresadas 1-3 folículos / pocillo S10B es suficiente para ver una señal fuerte en un western blot. Sin embargo, es importante hacer unamuestra representativa, teniendo folículos de varias hembras. De este modo, 15-20 folículos de una etapa particular se recogen por lo general. </li><li> Mueva folículos, usando una pipeta de vidrio, a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Haga girar brevemente en un mini-microcentrífuga para sedimentar los folículos (véase el paso 5.4). Retire con cuidado todos los medios de comunicación utilizando una pipeta de vidrio tirado (véase el paso 3.4) y añadir 50 l de PBS 1x y 50 l de tampón Laemmli 2x. </li><li> Triturar con la mano durante aproximadamente 20 segundos con una mano de mortero de plástico. NOTA: las majas de plástico pueden ser reutilizados para la molienda de muestras occidentales por el lavado y la esterilización en autoclave ellos. </li><li> Hervir las muestras durante 10 min en el bloque de calor. </li><li> Chill brevemente en hielo y centrifugar a toda velocidad durante 15 segundos en una microcentrífuga. Cualquiera de cargar inmediatamente en un gel de SDS-PAGE o almacenar a -20 ° C. NOTA: Si se almacenan las muestras, recuerde que debe recalentar las muestras antes de la carga en el gel. </li><li> Realizar análisis de Western blot siguiendo protocolos estándar. </li></ol>

<ol>
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No hay nada que revelar.

El folículo Drosophila se compone de sólo un pequeño número de tipos de células, por lo que es ideal para el estudio morfológico y análisis moleculares. Además, debido a la estructura del ovario, es relativamente fácil de obtener un gran número de etapas específicas de desarrollo del folículo con un microscopio de disección común y una formación mínima. A medida que cada etapa representa una ventana temporal corto, aislamiento etapa puede proporcionar conocimientos moleculares importantes en los...

Cada ovario de Drosophila se compone de ~ 16 ovarioles, o cadenas de forma secuencial con vencimiento cámaras de huevos o folículos. Cada folículo se compone de un único ovocito, 15 de la línea germinal derivadas células de la enfermera o de apoyo, y ~ 650 células somáticas denominadas células del folículo (Figura 1A). Drosophila ovogénesis se divide en 14 etapas morfológicamente definidas de desarrollo 1. Cada etapa de desarrollo del folículo se observa muchas veces dentro de una sola marcha, por lo que es relativamente fácil de aislar un número sustancial de los folículos etapa específica. Los mediados y finales de etapas de ovogénesis (Etapas 10B-14) son especialmente adecuados para el aislamiento de fase (Figura 1). En la Etapa 10B (S10B), el folículo está totalmente alargada (es decir, su longitud es igual a la de una etapa 14 (S14) folículo, véase la figura 1 y la figura 2H) y media la longitud del folículo se compone de células de la enfermeramientras que la otra mitad es el ovocito (Figura 1C). En esta etapa las células de la enfermera se someten a la remodelación de actina dramática, el fortalecimiento de la actina cortical y la generación de haces paralelos de filamentos de actina 2. Al mismo tiempo, una población de células del folículo, denominada células centrípetas, migrar entre las células de la enfermera y el ovocito, y dos grupos dorsales de las células del folículo se convierta especificado para someterse a la migración para formar los apéndices dorsales, aparatos respiratorios tubulares para el embrión 3 . Las células de la enfermera después de contrato (S11), apretando sus contenidos citoplasmáticos en el ovocito en un proceso llamado célula nodriza dumping, que proporciona el ovocito con los factores necesarios para que se complete la embriogénesis (Figura 1D). Las células de la enfermera a continuación, se someten a la muerte celular (S12-S13) 4, y las células del folículo secretan y el patrón de la cáscara de huevo 5 (Figuras 1E-G). Por lo tanto, el final de la ovogénesis es rica con un importante desarrollod procesos morfogenéticos. Folículos aislados entre mediados y finales de etapa (S10B-S14) se puede utilizar para una variedad de propósitos, incluyendo los análisis moleculares. Por ejemplo, ARNm a partir de folículos por etapas puede ser aislado por RT-PCR, microarrays, o los análisis de ARN-ss. Esto le permite a uno a ver la expresión de genes dentro de una ventana de desarrollo a corto, con sólo unos pocos tipos de células presentes, y determinar cómo la expresión génica se cambia por perturbaciones ya sea farmacológicos o genéticos. Aislamiento etapa también se puede utilizar para analizar las proteínas por Western Blot. Este análisis es importante porque permite cuantificar el nivel de expresión de la proteína de tipo salvaje frente a los mutantes en etapas específicas. Si bien se podría utilizar de inmunofluorescencia analiza para lograr resultados similares, la cuantificación de la fluorescencia es menos robusto debido a los requisitos estrictos que todos los píxeles dentro de la gama lineal de detección 6. Además, el análisis de transferencia Western puede proporcionar otra información, tals si la proteína se posttranslationally modificado o se expresa a partir de una isoforma de empalme específico. Etapas aisladas también se pueden usar para una mayor purificación de proteínas, incluyendo fraccionamiento subcelular o coimmunoprecipitation. Aislamiento folículo Etapa específica también puede ser utilizado para los ensayos in vitro en desarrollo 7 y en vivo de imágenes 8. Aislados folículos S10B-S13 continuarán desarrollando a S14 en medios de cultivo sencillo (ver abajo). Es importante tener en cuenta que los folículos S10A no progresar a través de célula nodriza de dumping utilizando las condiciones de cultivo se analizan en este manuscrito. Hemos utilizado en los ensayos in vitro de desarrollo S10B para definir el papel de las prostaglandinas, tanto farmacológica y genética, en la regulación de la remodelación de la actina utilizando células enfermera dumping y el desarrollo como leer-outs 7,9. Del mismo modo, las etapas posteriores del desarrollo también se pueden aislar para determinar los efectos de los tratamientos farmacológicos o hombre genéticaipulations sobre determinados procesos como la migración centrípeta celular, la migración apéndice dorsal / formación 10, y la muerte celular enfermera. Tales ensayos pueden ser utilizados para realizar pantallas de interacción dominantes o ensayos, por ejemplo, mientras que la heterocigosidad para mutaciones en PXT o Fascin solos no tienen efecto sobre S10B desarrollo in vitro, los folículos de los heterocigotos dobles célula nodriza de exposiciones de dumping defectos y un bloqueo en el desarrollo 9. Además, debido a S10B-13 puede desarrollarse en la cultura, todos los procesos que tienen lugar durante este tiempo se puede observar por las imágenes en vivo. Esta imagen se puede realizar simplemente usando luz transmitida (si uno está interesado sólo en los cambios en la morfología bruto) o con microscopía confocal utilizando moscas transgénicas que expresan las sondas o los folículos teñidas con tintes de imágenes en directo fluorescentes. Formación de imágenes en vivo se utiliza para avanzar sustancialmente nuestra comprensión de los procesos de desarrollo. De hecho, vivir imaging de los folículos en fase tardía se ha ampliado el conocimiento de la migración apéndice dorsal, un ejemplo de tubulogenesis 10. Esperamos que las imágenes en directo de los procesos finales de etapa adicionales, incluyendo la dinámica de actina durante célula nodriza de dumping, proporcionará nuevos conocimientos sobre estos eventos de desarrollo. Es importante señalar que si bien S10A y las primeras etapas de desarrollo de los folículos no continuarán desarrollando en un S14 en la cultura, en vivo de imágenes de los acontecimientos que ocurren durante esas etapas de desarrollo es posible utilizando condiciones de cultivo alternativos 11-14 (véase la discusión para más información). Aquí nos proporcionan protocolos detallados para aislar folículos en fase tardía, ya sea para el desarrollo in vitro y vivimos de imágenes, o los análisis moleculares (ARNm y de aislamiento de proteínas).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1098">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:253px;">Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:195px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:227px;">62-103</td>
			<td style="width:424px;">Any source of Active Dry Yeast is fine</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Grace&#8217;s Insect Media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-457F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11050H</td>
			<td>Any Heat Inactivated FBS should work</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">10x Pen/Strep</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pin Vises and Needles</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>13561-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Spot Plate, Nine Well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">#5 Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">24 multi-well plates</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>35 3226</td>
			<td>Any 24-well tissue culture dish should work</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coverslip Bottom Dishes (35mm)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td>Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glass pipettes</td>
			<td>Corning</td>
			<td colspan="2">7095B-5x (for transferring follicles)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glass pipettes - long</td>
			<td>Corning</td>
			<td colspan="2">7095B-9 (for producing pulled pipettes)</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Sample pestle (1.5 &#956;l; RNase/DNase free)</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>199228</td>
			<td>Any plastic pestle that fits 1.5 &#956;l microfuge tubes can be used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the utility of stage-specific mid-to-late drosophila follicle isolation

Ovogénesis Drosophila o el desarrollo del folículo ha sido ampliamente utilizado para avanzar en la comprensión de los complejos procesos biológicos celulares y de desarrollo. En este trabajo se describen los métodos de cómo aislar folículos etapa a mediados y finales de la etapa (10B-14) y utilizarlos para proporcionar nuevos conocimientos sobre los fenómenos moleculares y morfológicos que ocurren durante las ventanas cerradas de tiempo de desarrollo. Folículos aislados se pueden utilizar para una variedad de técnicas experimentales, incluyendo los ensayos in vitro en desarrollo, de formación de imágenes en vivo, análisis de la expresión de ARNm y análisis de transferencia Western de proteínas. Los folículos en Etapa 10B (S10B) o posterior completarán el desarrollo de la cultura, lo que permite combinar perturbaciones genéticas o farmacológicas con el desarrollo in vitro para definir los efectos de esas manipulaciones en los procesos que ocurren en períodos específicos del desarrollo. Además, debido a que estos folículos se desarrollan en la cultura, que son ideales para los estudios de imágenes en directo, Que a menudo revelan nuevos mecanismos que median los eventos morfológicos. Folículos aislados también se pueden utilizar para los análisis moleculares. Por ejemplo, los cambios en la expresión génica que resultan de perturbaciones genéticas se pueden definir para ventanas de desarrollo específicas. Además, el nivel de proteína, la estabilidad, y / o estado de modificación postraduccional durante una etapa particular del desarrollo del folículo pueden ser examinados a través de análisis de Western blot. Por lo tanto, el aislamiento de la etapa específica de los folículos de Drosophila proporciona una rica fuente de información en muy conservadas procesos de desarrollo y la morfogénesis.

Cuando el aislamiento de etapas específicas de desarrollo del folículo de Drosophila que es esencial para ser capaz de distinguir con precisión las diferentes etapas morfológicas. Esto es algo difícil para S10A y S10B, como las células de la enfermera y el ovocito cada uno ocupan la mitad de la longitud del folículo en estas etapas (Figura 1B comparó a 1C). Sin embargo, los folículos S10A son más cortos en longitud que los folículos S10B, como los folículos S10B est...

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The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

-Fase específica aislamiento de mediados y finales de los folículos de Drosophila es útil para una variedad de propósitos. Estos folículos se desarrollan en la cultura, lo que permite la manipulación genética y / o farmacológicos a acoplar con los ensayos in vitro de desarrollo en y de imagen en vivo. Además, los folículos se pueden utilizar para los estudios moleculares, tales como el aislamiento de ARNm y proteína.

La utilidad de la etapa específica-Mediados o finales<em&gt; Drosophila</em&gt; Aislamiento folículo

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

the-utility-stage-specific-mid-to-late-drosophila-follicle

Research

JoVE Journal

Biology

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

11.2K vistas.  University of Iowa Carver College of Medicine.  -Fase específica aislamiento de mediados y finales de los folículos de Drosophila es útil para una variedad de propósitos. Estos folículos se desarrollan en la cultura, lo que permite la manipulación genética y / o farmacológicos a acoplar con los ensayos in vitro de desarrollo en y de imagen en vivo. Además, los folículos se pueden utilizar para los estudios moleculares, tales como el aislamiento de ARNm y proteína. 

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Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft during early anagen, the growth phase of the hair cycle, as well as pluripotent stem cells that play a role in hair follicle growth but have the potential to differentiate to non-follicle cells such as neurons. These properties of the hair follicle are discussed. The various cell types of the hair follicle are potential targets for gene therapy. Gene delivery system for the hair follicle using viral vectors or liposomes for gene targeting to the various cell types in the hair follicle and the results obtained are also discussed.

The hair follicle is a highly complex appendage of the skin containing a multiplicity of cell types. The follicle undergoes constant cycling through the life of the organism including growth and resorption with growth dependent on specific stem cells. The targeting of the follicle by genes and stem cells to change its properties, in particular, the nature of the hair shaft is, discussed. Hair follicle delivery systems are described, such as liposomes and viral vectors for gene therapy. The nature of the hair follicle stem cells is discussed, in particular, its pluripotency.

Expresión específica de las buenas prácticas agrarias en el folículo del pelo usando Ex Vivo transducción viral

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

Investigación

Biología

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

Marcaje fluorescente de Drosophila Estructuras del Corazón

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Visualizar el corazón latiendo en Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Aislamiento y purificación de Drosophila Clasificación de las neuronas periféricas por bolas magnéticas

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

El aislamiento de Drosophila melanogaster Testículos

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Aislamiento y purificación de Kinesin desde Drosophila Los embriones

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Aislamiento a base de afinidad de Tagged Núcleos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los tejidos para análisis de expresión génica

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Aislamiento de Neonatal extrahepática cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Aislamiento de las células murinas de la válvula endoteliales

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...