Por ello, estudiamos los hidratos de carbono complejos, o glicanos, en el sistema inmunitario innato y los trastornos relacionados con el sistema inmunitario, centrándonos actualmente en la sepsis y el cáncer. Nuestro trabajo involucra métodos analíticos y sistemas de glicobiología, incluyendo métodos glicómicos y glicoproteómicos, para la caracterización detallada de la glicoproteína humana. La glicoproteómica ha experimentado enormes avances en las últimas décadas, y el progreso ya no está limitado por la escasez de datos de espectrometría de masas de alta calidad disponibles.
Más bien, el desafío es interpretar y generar conocimiento biológico a partir de los datos espectrales. El método de glicoproteómica guiado por glucómica permite a los científicos glicológicos obtener una visión profunda y precisa del glicoproteoma y las barreras duras con índices de salud humana, la glicoproteómica es la única capaz de generar información específica del sitio sobre el glicoproteoma. Pero las tasas de glicopéptidos siguen siendo altas.
Para abordar estos problemas de reproducibilidad, nuestro método de glicoproteómica glicómica permite la elaboración de perfiles de glicoproteoma de precisión mediante la definición de restricciones en el espacio de búsqueda de glicanos a través del estudio glucómico de la misma muestra. En última instancia, permite búsquedas de glicopéptidos más rápidas y precisas. Nuestro método de glicoproteómica guiado por glucómica permite un mapeo completo de la heterogeneidad y la dinámica de los índices de glicoproteoma de una variedad de especímenes humanos diferentes.
Por lo tanto, este método puede ayudarnos a comprender mejor la progresión de la enfermedad y también puede ayudarnos a encontrar nuevos biomarcadores de diagnóstico para dianas terapéuticas contra una amplia variedad de enfermedades humanas. El método de glicoproteómica guiada por glucómica permite descifrar la complejidad del glicoproteoma humano, lo que, a su vez, abre nuevas preguntas biológicas como cómo las estructuras de los glicanos afectan a la función de las proteínas, la comunicación celular o las respuestas inmunitarias. También plantea preguntas sobre cómo y por qué cambió el patrón de glicosilación en ciertas enfermedades.
Y estos conocimientos podrían conducir a descubrimientos y nuevos marcadores de diagnóstico y terapias personalizadas en enfermedades complejas. Para inmovilizar la proteína de interés en una membrana de PVDF, mediante una punción de un solo orificio, corte la membrana en función del número de muestras que se van a detectar. Humedece las membranas extirpadas con metanol y luego transfiérelas a una placa de fondo plano de 96 pocillos.
Una vez que las membranas estén casi secas, aplique 2,5 microlitros de muestras de proteínas por punto. Seque las membranas al aire libre a 20 a 25 grados centígrados durante al menos tres horas, o preferiblemente durante la noche, teniendo cuidado de evitar la contaminación. Agregue 100 microlitros de 1%PDP-40 en metanol a cada pocillo que contenga las membranas manchadas.
Agite la placa en la solución PDP-40 a 20 a 25 grados centígrados. Después de cinco minutos, deseche la solución PDP-40. A continuación, lave cada pocillo que contenga las manchas de proteínas bloqueadas con 100 microlitros de agua ultrapura y agite el plato durante cinco minutos.
Agregue 15 microlitros de solución de PNGasa F a cada pocillo. Para evitar la deshidratación, agregue agua a los pozos vacíos circundantes. Selle la placa cuidadosamente con una película transparente e incube durante al menos ocho horas a 37 grados centígrados.
Después de la incubación, sonique la placa durante cinco minutos para ayudar a que las gotas evaporadas en los lados de los pocillos se acumulen en el fondo. Transfiera las muestras de N-glicanos liberadas a tubos individuales de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Lave cada pozo de muestra dos veces con 20 microlitros de agua ultrapura, aspirando y combinando todas las muestras restantes en los tubos nuevos.
A continuación, agregue 10 microlitros de acetato de amonio de 100 milimolares pH 5 e incube las muestras durante una hora a 20 a 25 grados centígrados. Seque las muestras de N-glicanos en un sistema concentrador de vacío. Para preparar carbono de grafito poroso casero, o extracción en fase sólida PGC-C18, o microcolumnas SPE, utilice una jeringa para conectar y transferir discos C18 a puntas de pipeta de 10 microlitros.
Pipetear una lechada de resina PGC de 10 microlitros suspendida en metanol al 50% en las microcolumnas C18 SPE. Coloque las microcolumnas en tubos de 2 mililitros con adaptadores de microcentrífuga. Gire los tubos para crear microcolumnas PGC-C18 SPE con una altura aproximada de columna de 0,5 centímetros.
A continuación, añada 50 microlitros de ácido trifluoroacético al 0,1%, o TFA, en acetonitrilo en las microcolumnas y centrifugar a 2000 G durante 60 segundos para facilitar el paso de las fases móviles a través de las microcolumnas. Del mismo modo, lavar y acondicionar las microcolumnas tres veces con TFA acuoso al 0,1%. Aplique las muestras de N-glicanos a cada microcolumna en volúmenes de carga de hasta 40 microlitros.
Gire la microcolumna después de cada edición, repitiendo hasta que se cargue toda la muestra. Lavar cada microcolumna con 20 microlitros de agua ultrapura. Transfiera las microcolumnas a nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Para eluir los N-glicanos, añadir 40 microlitros de 0,1%TFA en acetonitrilo al 50%a cada microcolumna. Gira los tubos y combina el eluido de cada giro. Secar los N-glicanos desalados en un sistema de concentradores de vacío.
Examine los datos brutos de LC-MS/MS generados con el software adecuado. Confirme la alta calidad de los datos mediante la evaluación del estrecho ancho de pico de LC, la separación efectiva de los isómeros de N-glicanos, la alta precisión, la resolución y la relación señal-ruido de MS, junto con la alta eficiencia de fragmentación de CID MS/MS. Identifique manualmente los N-glicanos en la muestra en función de la masa del precursor monoisotópico, los patrones de fragmentación de CID MS/MS y los tiempos de retención relativos y absolutos de PGC-LC.
Para la cuantificación relativa de N-glicanos, genere una lista de transición que contenga la relación entre la masa del precursor monoisotópico y la carga para todos los isómeros de N-glicanos identificados. Determine el área bajo los valores de la curva de los cromatogramas iónicos extraídos de todos los iones precursores de N-glicanos. Para preparar las microcolumnas ZIC-HILIC-C8-SPE, con una jeringa, conecte y transfiera los discos C8 a puntas de pipeta de 10 microlitros.
Depositar una lechada de resina ZIC-HILIC suspendida en metanol en las microcolumnas C8-SPE. Coloque las microcolumnas en tubos de 2 mililitros con adaptadores de microcentrífuga, asegurándose de que las columnas estén suspendidas en el centro. Girar para crear microcolumnas de HPLC C8-SPE con una altura aproximada de un centímetro.
Añadir 50 microlitros de metanol en las microcolumnas y centrifugar a 2000 G durante 60 segundos, permitiendo que las fases móviles pasen a través de la columna. Del mismo modo, lavar las microcolumnas tres veces, cada una con 50 microlitros de agua ultrapura seguida de 50 microlitros de 1% de TFA en 80% de acetonitrilo. Vuelva a suspender las mezclas de péptidos secos designadas para el enriquecimiento de N-glicopéptidos en 50 microlitros de 1% de TFA en acetonitrilo al 80% y mezcle bien.
Coloque las microcolumnas de condición ZIC-HILIC-C8-SPE en tubos nuevos de 1,5 mililitros con adaptadores de microcentrífuga. Aplique las mezclas de péptidos resuspendidos a cada microcolumna y centrifuga a 2000 G durante 60 segundos. Recoja el flujo a través de fracciones y vuelva a aplicar cada fracción a la misma microcolumna ZIC-HILIC-C8-SPE.
A continuación, eluir el N-glicopéptido con la adición secuencial de 50 microlitros de bicarbonato de amonio de 25 milimolares y 50 microlitros de acetonitrilo al 50%. Transfiera las microcolumnas a nuevos tubos de microcentrífuga de baja unión de 1,5 mililitros. Para eluir secuencialmente el N-glicopéptido retenido, añadir 50 microlitros de TFA acuoso al 0,1% en las microcolumnas y centrifugar a 2000 g durante 60 segundos.
A continuación, eluir el N-glicopéptido con la adición secuencial de 50 microlitros de TFA acuoso al 0,1 %, seguidos de 50 microlitros de bicarbonato de amonio de 25 milimolares y 50 microlitros de acetonitrilo al 50 %. Recoja, combine y seque los N-glicopéptidos enriquecidos y el flujo de péptidos no modificados a través de fracciones en un sistema concentrador de vacío. El análisis de los datos de N-glicomica identificó 76 isómeros de N-glicanos en tejidos de cáncer colorrectal con 70 % de glicanos complejos/híbridos, 20 % de oligomamanosa y 10 % de paucimanosa.
Todas las estructuras de N-glicanos se confirmaron con evidencia espectral, cuantificada utilizando los valores de área bajo la curva de los cromatogramas iónicos extraídos.
