La estrategia de cromatografía de afinidad de metal inmovilizada de titanio de doble funcionalidad puede enriquecer tanto N-glicopéptidos como fosfopéptidos en el mismo flujo de trabajo, aumentando la información biomolecular del mismo análisis. La principal ventaja de este enriquecimiento son dos mecanismos de separación, que permiten la separación simultánea de N-glicopéptidos y fosfopéptidos en fracciones separadas para el análisis de espectrometría de masas aguas abajo. El uso de este método de enriquecimiento puede mejorar la detección de la glicosilación y la fosforilación en muestras biológicas complejas como los tejidos pancreáticos hacia el descubrimiento de biomarcadores de enfermedades, como en la diabetes y el cáncer.
Debido a que este método se basa en puntas de centrifugación y centrifugación, es importante controlar la velocidad de centrifugación y asegurarse de que las muestras estén libres de partículas para evitar cualquier obstrucción. Para comenzar, enfríe previamente las partes del pulverizador de tejido que entrarán en contacto con los tejidos pancreáticos, a saber, la cámara, el pulverizador y la cuchara de recuperación, junto con las espátulas, en un recipiente de poliestireno. A continuación, transfiera las piezas de tejido al soporte de muestra preenfriado y agregue un nitrógeno líquido al tejido hasta que se congelen.
Después de colocar el pulverizador en la cámara, golpearlo con un mazo de cinco a diez veces para aplastar la muestra, luego retire el pulverizador de la cámara y raspe el polvo y los trozos de tejido adherente. A continuación, agregue una cucharada de nitrógeno líquido a la cámara si los tejidos comienzan a derretirse, y repita el proceso de pulverización hasta que se obtenga un polvo fino y divida las muestras en aproximadamente 100 miligramos de alícuotas en tubos preenfriados. Después de preparar el tampón de lisis, disuelva una tableta cada una de proteasas e inhibidores de la fosfatasa en 500 microlitros de agua, para un stock de 20 veces la concentración final deseada, y agregue el volumen requerido de stock de cada inhibidor al tampón de lisis para lograr las concentraciones finales del inhibidor.
Después de agregar 600 microlitros de tampón de lisis al tubo, incube a 95 grados Celsius en el bloque de calentamiento durante 10 minutos con agitación a 800 RPM, luego retire las muestras del bloque de calentamiento y déjelas enfriar a temperatura ambiente. A continuación, sonice las muestras a una energía de 60 vatios durante 45 segundos, utilizando pulsos de 15 segundos con un descanso de 30 segundos en el medio, y peletice las muestras a 3000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Agregue el sobrenadante a cinco veces su volumen de disolvente de precipitación.
Por ejemplo, 300 microlitros de tampón de lisis a 1,5 mililitros de disolvente de precipitación que contiene 50% de acetona, 49,9% de etanol y 0,1% de ácido acético, luego se enfrían durante la noche a 80 grados centígrados. Peletizar las muestras de nuevo a 3000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados, y retirar el sobrenadante, luego lavar el pellet rompiendo con una espátula y mezclar con la misma cantidad de disolvente de precipitación. Después de centrifugar, seque al aire el pellet de muestra en una campana de humos durante 15 minutos y guárdelo a 80 grados centígrados hasta que esté listo para continuar.
Primero, vuelva a suspender el pellet de proteína en 300 microlitros de tampón de digestión recién hecho que contiene 50 tampón de bicarbonato de trietilamonio milimolar y ocho urea molar. A la proteína en solución, agregue ditiotreitol a una concentración final de cinco milimolares, mezcle y reduzca a temperatura ambiente durante una hora, luego agregue yodoacetamida a una concentración final a 15 milimolares. Mezclar y alquilar a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad.
A continuación, agregue Lys-C / Tripsina en una proporción de 1 a 100 enzimas a proteínas, e incube a 37 grados Celsius en una incubadora durante cuatro horas, luego agregue un tampón de bicarbonato de trietilamonio milimolar de 50 milimolares para diluir la urea molar de ocho molares utilizada a menos de un molar. Después de agregar tripsina en una proporción de 1 a 100 enzimas a proteínas, incube a 37 grados Celsius en una incubadora durante la noche, posteriormente apague la digestión con la adición de ácido trifluoroacético. Por cada miligramo de proteína de partida, acondicione un cartucho desalinizante con un mililitro de acetonitrilo y tres veces con un mililitro de ácido trifluoroacético al 0,1%, luego cargue la mezcla digerida en el cartucho desalante y lave la mezcla tres veces con un mililitro de ácido trifluoroacético al 0,1%.
A continuación, eluye péptidos usando un mililitro de 60% de acetonitrilo y 0.1% de solución de ácido fórmico, luego seque péptidos eluidos a aproximadamente 35 grados Celsius usando un concentrador de vacío centrífugo hasta que el solvente se haya evaporado por completo. Después de volver a suspender los péptidos en agua, estime las concentraciones de péptidos utilizando un ensayo de péptidos de acuerdo con el protocolo del fabricante, luego divida los péptidos en alícuotas de 500 microgramos y séquelos por completo. Pesa aproximadamente tres miligramos de algodón y empaca en una punta de giro vacía.
Después de transferir un gramo de material de cromatografía de afinidad de metal inmovilizado de titanio a un tubo, agregue ácido trifluoroacético al 0,1% a una concentración conocida de material. Después de agregar suficiente lechada a una punta de centrifugado para transferir 20 miligramos de material, lave la punta de centrifugado centrifugando con 200 microlitros de ácido trifluoroacético al 0.1%. Vuelva a suspender las muestras en 200 microlitros de disolvente de carga/lavado y fluya a través de la punta de centrifugado.
Después de lavar la punta de centrifugado por centrifugación con disolvente de carga / lavado, lave la punta de centrifugado con 200 microlitros de solución de ácido fórmico 80% de acetonitrilo 0.1, luego eluya los péptidos con 200 microlitros de E1 y E2, y analice cada elución por separado. Repita el proceso de elución utilizando disolventes E3 y E4, y combine las fracciones de elución apropiadas antes del análisis posterior. Antes de realizar las eluciones a pH básico, acondicionar el material tres veces utilizando 200 microlitros de 90% de acetonitrilo en hidróxido de amonio al 2,5%, luego eluir los péptidos con 200 microlitros de disolventes E5 y E6, y analizar estas eluciones por separado después de desalinizar con una punta envasada.
A continuación, eluya los péptidos con 200 microlitros de diferentes concentraciones de acetonitrilo e hidróxido de amonio. Después, combine estas eluciones y analice como una muestra, E7, después de desalinizar con una punta empaquetada. Se obtuvieron espectros de MS/MS anotados de alta confianza de péptidos N-glicosilados y fosforilados con una rica fragmentación de precursores, lo que aumentó la confianza en la identificación, según lo asignado por el software de búsqueda de bases de datos.
Se encontraron identificaciones de péptidos a partir de muestras enriquecidas utilizando el método de punta de espín de afinidad metálica inmovilizada de titanio de doble funcionalidad sobre cada fracción de elución. La mayoría de los glicopéptidos eluyen en las primeras cuatro fracciones, mientras que la mayoría de los fosfopéptidos eluyen en las últimas tres fracciones, disminuyendo las posibles interferencias en la ionización. Los resultados de la glicoproteómica del método dual de titanio se compararon con un enriquecimiento solo de glicopéptido de Ehrlich, lo que demuestra que las proporciones de cada tipo de glicano después de agruparse en seis categorías según sus composiciones, son similares entre ambos métodos.
Los resultados de la fosfoproteómica del método dual de titanio se compararon con una cromatografía de afinidad metálica inmovilizada convencional de enriquecimiento solo de fosfopéptidos o utilizando ambos métodos. La mayoría de los aminoácidos fosforilados se identificaron como serina y treonina, con alrededor del 1% de tirosina fosforilada. Construir correctamente la punta de giro es importante para garantizar una elución suave.
Enchufe el algodón firmemente en la punta, de modo que el material de enriquecimiento se pueda empacar sobre el algodón. Hemos utilizado el método IMAC de titanio de doble funcionalidad para la caracterización simultánea de la glicosilación y la fosforilación en la mayoría de los tejidos y la proteína espiga del SARS-CoV-2.
