Nos gustaría agradecer a Mark Lucanic y Cheng Hwai-Jong en busca de ayuda con la adquisición de las imágenes de bajo aumento de la totalidad de rodajas de hipocampo presenta en este video. También nos gustaría agradecer a Sarah Parrish para ayudar con el texto que acompaña al video.

PROTOCOLO para la transfección biolística Hacer balas Las balas son buenas para un máximo de 6 meses, pero puede comenzar a disminuir en la eficiencia de la transfección después de 2-3 meses. Las balas deben ser almacenadas a 4 ° C en presencia de gránulos de desecante. Siempre que los viales de centelleo, en el que se almacenan las balas, la temperatura ambiente antes de abrir el vial. Antes de empezar se han preparado: <ul><li> Espermidina (0,05 M) </li><li> CaCl2 (1M) </li><li> EtOH (100%-de alto grado sin abrir la botella) </li><li> Autoclave H 2 0 </li><li> De ADN que se transfectaron </li><li> Polivinilpirrolidona (PVP-20 mg / ml) </li><li> 2 X 15 mL cónico (2/bullet juego) </li><li> Tubos (cortado en 1 X ~ 30 pulgadas / conjunto de bala) </li><li> Centelleo viales (conjunto 1/bullet) </li><li> Pellets de desecación </li><li> 10 ml jeringa w / tubo en el extremo </li></ul> Prepare la tubería: <ol><li> Seca ~ 30 pulgadas de tubo (cerca de 2 pulgadas se extiende más allá del bien O-ring) en la estación de tubo w / N 2 gas (0,4 de presión) por un mínimo de 20 min. </li></ol> Precipitar el ADN de cuentas de oro: <ol><li> Prepare de ADN que se transfectadas en un volumen de 50 μmL total en tubo de microcentrífuga (máximo 50 mg de ADN total) </li><li> Pesar de 6.8 mg de oro y la transferencia a un tubo de microcentrífuga </li><li> Añadir 100 ml de 0,05 M espermidina de oro y ultrasonidos durante 20 segundos </li><li> Agregue el l 50 de ADN para el oro / espermidina </li><li> Vortex (en torno al establecimiento de 5) w / tapa abierta </li><li> Añadir gota a gota 100 l de 1 M de CaCl2 </li><li> Tratar brevemente con ultrasonidos (&lt;5 segundos) </li><li> Dejar decantar durante 10 minutos a temperatura ambiente </li><li> Tratar brevemente con ultrasonidos </li></ol> Prepare una solución de PVP en ultrasonidos: <ol><li> Haz una solución diluida de PVP en cónico de 15 ml, diluir 3.5mL PVP para cada conjunto de puntos (añadir 7,5 l de 20mg/ml acciones PVP a 3,5 ml EtOH al 100%) </li></ol> Enjuague cuentas de oro con EtOH: <ol><li> Decantar cuentas de oro a toda velocidad durante 10 segundos en microcentrífuga </li><li> Desechar el sobrenadante, pero mantener una pequeña cantidad de líquido en la parte superior de perlas de oro </li><li> Lave 3 veces con 1 ml de EtOH, tratar brevemente con ultrasonidos cada vez, si es necesario </li></ol> Resuspender oro / ADN en la solución de PVP: <ol><li> Resuspender el precipitado de oro en 200 l de los 3,5 ml diluida PVP / EtOH solución </li><li> Vortex la bolita de oro para volver a suspender (breve ultrasonidos, si es necesario) </li><li> Transferir el l 200 de oro / solución de PVP de un nuevo cono de 15 ml </li><li> Continúe de esta manera, la adición de 200 L de PVP en un momento hasta que todo el oro ha sido transferido a la forma cónica de 15 ml, y el volumen final es de 3,2 mL </li></ol> Revestimiento de la tubería: <ol><li> Apague el N 2 en la estación de la tubería y remover el tubo seco </li><li> Conecte el tubo de secado a la jeringa de 10 ml </li><li> Agitar enérgicamente el cónico de 15 ml llena de oro / PVP </li><li> Coloque el extremo del tubo de oro / solución de PVP y aspirar lentamente con cuidado para evitar las burbujas </li><li> Deja ~ 2 pulgadas en seco de los dos extremos de la tubería </li><li> Con el tubo todavía unido a la jeringa y se llena con la solución de oro / PVP, se coloca cuidadosamente el tubo en la estación </li><li> Marcan el final del tubo donde se encuentra la solución </li><li> Deje que el oro reposar durante 5 minutos con la jeringa acoplada </li><li> Succión de la solución muy lentamente tirando de la jeringa para que el oro se establecieron se quede atrás (que no está seguro de hacer una copia de lavado) </li><li> Desconecte la jeringa </li><li> Girar 90 ° y deje reposar 2 segundos </li><li> Girar 180 ° y deje reposar de 2 segundos </li><li> Rotar el tubo durante 5 segundos </li><li> Encienda el N 2, de modo que la válvula se lee entre 0,4 a 0,5 y girar el tubo recubierto de oro durante el secado de 5 min. </li></ol> Corte de la tubería: <ol><li> Retire el tubo de la tubería de la estación de preparación y corte los extremos en las marcas. </li><li> Ponga un vial de centelleo etiquetados bajo el helicóptero tubo para coger los cartuchos de corte </li><li> Coloque los tubos en el helicóptero tubería y cortar el tubo con la navaja de limpieza </li><li> Coloque una pellets desecación en vial de centelleo </li><li> Almacene los cartuchos a 4 ° C </li></ol> Disparos cortes de tejido Al disparar rebanadas cultivadas, es importante emplear una técnica relativamente estéril, con el fin de evitar la contaminación. Recuerde, que al disparar dos construcciones diferentes, ambos conjuntos de balas se pueden cargar en el soporte del cartucho mismo, pero el barril-liner y la pantalla debe ser cambiado entre las construcciones. Antes de empezar se han preparado: <ul><li> Balas de ADN (que vial de centelleo de la temperatura ambiente antes de la apertura) </li><li> Cortes de tejido </li><li> Helios pistola de genes </li><li> Tanque de helio con una manguera de pistola de genes unidos &lt;/ Li&gt; <li> Cartucho de titular </li><li> Revestimiento de barril de plástico con junta tórica en su lugar </li><li> Difusor (modificado) </li><li> Difusor de pantalla </li><li> Fórceps </li></ul> Preparar la pistola de genes: <ol><li> Utilizando unas pinzas colocar los cartuchos de oro recubiertas de plástico en el soporte del cartucho. </li><li> Coloque el soporte del cartucho en la pistola de genes, en primer lugar hacer retroceder bloqueo </li><li> Asegure el soporte del cartucho con el bloqueo </li><li> Obtener un revestimiento de cañón con una junta tórica y el difusor en su lugar </li><li> Atornille el barril-liner en la pistola de genes </li></ol> Disparos rodajas cultivadas con la pistola de genes: <ol><li> Póngase tapones para los oídos </li><li> Conecte la pistola de genes en la manguera conectada tanque de gas helio </li><li> A su vez la presión en el tanque de 180 PSI </li><li> Disparar a un blanco en el aire con el fin de eliminar el polvo y los escombros de la pantalla difusora. Para disparar el arma, primero presione el botón de bloqueo de seguridad hasta que suene el arma, luego apretar el gatillo. </li><li> Después de disparar el espacio en blanco, quitar los trozos de la incubadora </li><li> Avance arma para construir primero </li><li> Dispara con el difusor de 0,5 a 1 pulgada de la parte </li><li> Avanzar en el cartucho entre los pozos. </li><li> Después de disparar el último pozo, colocar las rodajas de nuevo en la incubadora </li><li> Apague la presión del gas y la liberación antes de desmontar la pistola de la manguera de helio </li><li> Desenroscar el barril de línea, y retire el cartucho y las conchas utilizadas </li></ol> Limpieza de cartucheras y fundas barril: <ol><li> Cartuchos de lugar, revestimientos barril, y las pantallas de difusor en un vaso con agua y jabón </li><li> Lugar vaso en baño de ultrasonido y sonicar durante 20 minutos </li><li> Lave con abundante agua hasta que todos los residuos de jabón se eliminan </li><li> Remoje en un 70% EtOH durante una hora </li><li> Colocar en una toalla de papel seca durante la noche para en seco </li><li> Limpiar los cartuchos, los revestimientos barril, y las pantallas se puede reutilizar en posteriores transfecciones biolística </li></ol> Consejos de resolución de problemas para la transfección biolística Transfección biolística a veces puede resultar en condiciones óptimas de transfección. Esto puede llevar a muy pocos o muy transfectadas muchas células, demasiado alta o demasiado baja los niveles de expresión, o pueden causar cortes de tejido para ser generalmente insalubres. A menudo, las rebanadas consecuencia malsana de la explosión de presión. Estos son algunos consejos para obtener de manera óptima transfectadas cortes de tejido. Si los segmentos parecen ser poco saludables (o si demasiadas células son transfectadas / corte), trate de: <ul><li> aumentar la distancia de tiro </li><li> disminuir la presión en el tanque de gas </li><li> disminuir la cantidad de oro </li><li> cortando el centro del difusor Bio-Rad y la sustitución del centro, con una pantalla difusora. </li></ul> Si las células son muy pocos los transfectadas, trate de: <ul><li> disminuyendo la distancia de disparo </li><li> aumento de la presión en el tanque de gas </li><li> el aumento de la cantidad de oro </li><li> aumentar el número de cortes de tejido / bien </li><li> asegúrese de que la junta tórica en el barril-liner está intacto. </li></ul> Si usted obtiene con las dos rebanadas de demasiadas células transfectadas y muy pocos en el rodaje mismo asegúrese de que: <ul><li> que usted está sosteniendo el arma sobre simétricamente bien </li><li> que el oro es uniformemente recubrir el interior de la tubería. (Si usted está recibiendo una línea de oro, extraer el sobrenadante de la tubería a un ritmo más rápido una vez que el oro se ha asentado y gire el oro ya antes de encender el nitrógeno. Si, por el contrario, vas a encontrar vetas de oro , esto es probablemente debido a la exposición a un exceso de humedad durante la fabricación de bala: asegúrese de que está utilizando una botella sin abrir de EtOH, que el tubo esté completamente seco antes de pintar, y que las tapas de nivelación y preparación de las balas en el momento oportuno). </li></ul> Si la eficiencia de transfección parece óptimo (# células transfectadas / corte), pero el nivel de expresión parece demasiado alto o demasiado bajo: <ul><li> ajustar el ADN relación al oro. (Por ejemplo, si es demasiado baja mantener la cantidad de oro, pero aumentar la cantidad de ADN.) </li><li> ajustar la cantidad de tiempo entre la toma y recolección de datos </li></ul> En el caso de la transfección doble, si usted está recibiendo muy poca expresión de uno de sus construcciones, ajustar la relación de las dos construcciones de la manera adecuada y asegúrese de que ambas construcciones se encuentran bajo el mismo promotor, a fin de asegurarse de que una promotor no fuera de competencia a la otra.

<ol>
	<li>Klein, T. M., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+foreign+genes+into+intact+maize+cells+with+high-velocity+microprojectiles.">Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).</li><li>Wellmann, H., Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocol+for+biolistic+transfection+of+brain+slices+and+dissociated+cultured+neurons+with+a+hand-held+gene+gun.">Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun.</a> J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).</li><li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biolistic+transfection+of+neurons.">Biolistic transfection of neurons.</a> Sci. STKE. 51, 1-13 (2000).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li></ol>

Transfección biolística es un medio físico de la transfección de células a través de bombardeo de los tejidos vivos de alta velocidad de las partículas de oro recubiertas de ADN. En la transferencia de genes mediada por partículas, en general, las células transfectadas se producen cuando la bala se detiene en el núcleo. Mientras que muchos métodos de transfección existen diferentes, tales como la microinyección, lipofección, fosfato de calcio transfección, electroporación y transfección viral, la transfección biolística puede ofrecer una mano de obra menos intensiva y alternativa eficiente para la transfección de células que no son fácilmente transfectadas con estos otros métodos. De hecho, fue desarrollado como una técnica de transferencia de genes en las plantas ya que la presencia de la pared celular hecho difícil transfección mediante métodos preexistentes 1. Del mismo modo, biolística ha ganado popularidad en el campo de la neurobiología ya que las neuronas post-mitóticas son muy difíciles de transfectar 2,3. En particular, es ampliamente reconocido como la técnica de principio a ser utilizados en experimentos destinados a evaluar la morfología fina de neuronas individuales en rodajas de cerebro intacto. Los métodos descritos aquí dar una explicación completa y detallada de cómo llevar a cabo la transfección biolística de rodajas de cerebro de cultivo con una mano gen-gun (el sistema Helios Gene Gun Bio-Rad). Transfección biolística se ha convertido en el método preferido para la transfección de las neuronas en la cultura de corte, ya que permite la transfección de un escaso número de células a lo largo de la porción del cerebro. De esta manera, las neuronas individuales pueden examinarse de manera aislada. Dado que esta técnica es especialmente adecuado para la transfección de las neuronas en cortes de cerebro, a menudo se utiliza en combinación con 2-fotón microscopio, ya que dos fotones de excitación permite la visualización de las células de la etiqueta fluorescente en lo profundo de los tejidos dispersión de la luz 4. De hecho las imágenes de gran aumento de las neuronas piramidales única presentada a través de este vídeo se capturaron con una hecha a la medida de 2 fotones microscopio de barrido láser. En conclusión transfección biolística es un medio eficaz para la transfección de células individuales en el contexto de una alta densidad de las células circundantes, y como tal ha demostrado ser extremadamente útil para la fluorescencia de etiquetado neuronas individuales en la cultura de corte neuronal.

Aunque hemos hecho una lista de todos los productos por separado, es más económico comprar &quot;Helios Gene-Gun System&quot;, que incluye todos los productos de Bio-Rad mencionados anteriormente (cat # 165 hasta 2.431).

preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture

Transfección biolística es un medio físico de la transfección de células de los tejidos mediante el bombardeo con partículas de alta velocidad de ADN recubierto. Ofrecemos un protocolo detallado para la transfección biolística de rodajas de hipocampo de rata, desde la preparación inicial de las balas recubiertas de ADN con el tiroteo final de las culturas rebanada organotípicos con una pistola de genes. Transfección de genes arma es un medio eficiente y fácil de transfectar neuronas y es especialmente útil para el etiquetado fluorescente de un pequeño subconjunto de las células en el segmento del tejido. En este video, lo primero que describen los pasos necesarios para capa de partículas de oro con el ADN. A continuación se muestra cómo la línea interior de un tubo de plástico con las balas de oro / de ADN, y la forma de cortar este tubo para obtener los cartuchos de plástico para la carga en la pistola de genes. Finalmente, se realiza la transfección biolística de las culturas de ratas rebanada hipocampo, lo que demuestra el manejo de la Bio-Rad Helios pistola de genes, y ofrecer asesoramiento resolución de problemas para obtener cortes de tejido sano y transfectadas de manera óptima.

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Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Se describe un método para la preparación de las balas recubiertas de oro de ADN y demostrar el uso de balas como para transfectar biolistically neuronas en cultivos de rodajas de hipocampo.

Preparación de balas de cañón de genes y transfección biolística de neuronas en cultivo Cortar

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

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Research

JoVE Journal

Biology

52.2K vistas.  University of California, Davis. Se describe un método para la preparación de las balas recubiertas de oro de ADN y demostrar el uso de balas como para transfectar biolistically neuronas en cultivos de rodajas de hipocampo.

Video: Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of retinal neurons, such as amacrine cells, expand their dendrites horizontally, so that the morphology of the cells is supposed to be severely damaged in the vertical slices. In the whole-mount preparation, especially for patch-clamp recordings, retinal neurons in the middle layer are not easily accessible due to the extensive coverage of glial cell (Mueller cell) s endfeets. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact. The slice was made horizontally at the inner layer of the retina using a vibratome slicer after the retina was embedded in the low-temperature melting agarose gel. In this horizontal slice preparation of the retina, we studied the function of retinal neurons compared with their morphology, by using patch-clamp recording, calcium imaging technique, immunocytochemistry, and single-cell RT-PCR.

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact.

Preparación de corte horizontal de la retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of ...

Investigación

Biología

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Gene-gun Transfección de las neuronas del hipocampo

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

Cultura Cortar organotípicos de los cerebros de ratas E18

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

Cultura de células dendríticas mieloides a partir de precursores de médula ósea

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for neuronal survival and function. Neurotrophins are specifically required to maintain the survival and differentiation of innervating sensory neurons but the question of how these target-derived neurotrophins communicate to the cell body of innervating neurons has been an area of active research for over 30 years. The most commonly accepted model of how neurotrophin signals reach the cell body proposes that signaling endosomes carry this signal retrogradely along the axon. In order to study retrograde transport, a culture system was originally devised by Robert Campenot, in which cell bodies are isolated from their axons. The technique of preparing these compartmented chambers for culturing sensory neurons recapitulates the selective stimulation of neuron terminals that occurs in vivo following release of target-derived neurotrophins. Retrograde signaling events that require long-range microtubule dependent retrograde transport have important implications for the treatment of neurodegenerative disorders.

Here we describe the technique of preparing and maintaining compartmented chambers for culturing sensory neurons of the dorsal root ganglia.

Preparación y mantenimiento de las neuronas dorsales ganglios de raíz en las culturas con compartimientos

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolecular complementación de fluorescencia (BiFC) Ensayo de interacción proteína-proteína en las células de cebolla con la pistola de genes Helios

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

Aislamiento y cultivo de células de la zona nefrogénica del riñón de embriones de ratón

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Inducción y prueba de hipoxia en el cultivo celular

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

El aislamiento de los ribosomas polipéptidos nacientes Bound<em&gt; In vitro</em&gt; Para la identificación de sitios de traslación pausa a lo largo del ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.