Nuestro laboratorio de investigación es apoyado por el Programa de Investigación Intramural del NIH, el Instituto Nacional sobre el Abuso de Alcohol y Alcoholismo.

<html> I. Preparación para la inyección Esta sección describe los pasos de preparación que deben tomarse antes de la inyección de cDNA en el núcleo de las neuronas. El procedimiento de aislamiento de las neuronas está fuera del alcance de este artículo, pero es importante que las neuronas disociadas en las células individuales y adherirse bien a la superficie inferior de 35 placas de cultivo celular mm (véase la discusión de consejos útiles para lograr esto). Aunque una variedad de diferentes neuronas podría ser utilizado, los ganglios periféricos, tales como los ganglios cervical superior (SCG) o los ganglios de la raíz dorsal son los preferidos para la disección, porque son de fácil acceso y el rendimiento de un gran número de neuronas. Otras ventajas de la utilización de las neuronas SCG es que son una población relativamente homogénea de las células y bien caracterizados 1,2,3,4. A. Preparación del plásmido cDNA para la inyección <ol><li> Para evitar la contaminación o degradación del ADN, se deben usar guantes durante la preparación. </li><li> ADN que codifica la proteína de interés se subclona en un vector de expresión adecuado de mamíferos, tales como PCI (Promega, Madison, WI), bajo el control del citomegalovirus muy activa y constitutiva (CMV). Si la proteína no está etiquetado, un plásmido reportero, EGFP codificación, por ejemplo (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), es co-inyección para confirmar el éxito de la inyección y la expresión. El ADN es aislado mediante una columna de separación de alta calidad (por ejemplo, QIAfilter Midi-prep kit, Qiagen, Chatsworth, CA) y se purifica aún más con una unidad de filtro centrífugo con un filtro PVDF (0,1 micras, Millipore, Bedford, MA) para eliminar las partículas en el preparación de plásmidos, que pueden obstruir las pipetas de inyección durante el proceso de inyección. Los plásmidos son almacenadas a -20 ° C a una concentración de aproximadamente 1 mg / l en un buffer de ADN de almacenamiento adecuado (por ejemplo, tampón TE: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0). </li><li> Inmediatamente antes de la microinyección, ADNc del plásmido se diluyen y se mezcla con la concentración final deseada en buffer TE o H 2 O. Por lo general, 5-10 ng / l del gen reportero es suficiente para marcar a las células inyectadas, y la concentración total de cDNA para ser inyectado no debe superar los 200 ng / l ya que el ADN es viscoso en altas concentraciones y puede obstruir las pipetas de inyección. Un pequeño volumen de cDNA para la inyección (50 a 10 l) se prepara mezclando gotas de la solución sobre la superficie limpia de un pequeño trozo de Parafilm (lateral por debajo del soporte de papel). Mezclar las gotas de la solución, junto con pipeta hacia arriba y abajo varias veces con un pipetor y evitar la introducción de burbujas de aire durante la mezcla. </li><li> Usando una punta de pipeta microloader (Eppendorf, Brinkmann Instruments, Westbury, NY), la transferencia de la solución de cDNA a un tubo de hematocrito especialmente preparado (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Vea la sección de materiales para obtener instrucciones sobre la preparación de los tubos de hematocrito (Tabla de Materiales). Coloque el tubo de hematocrito que contiene la solución inyectable de cDNA en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Centrifugar el tubo durante 15-30 min a 10 000 g en una microcentrífuga equipado con un rotor de cubeta de ángulo fijo o balanceo (Eppendorf), a temperatura ambiente (20-24 ° C) a las partículas de sedimento en la solución de cDNA que pueda bloquear las microinyección pipeta. La solución inyectable de ADNc se pueden mantener a temperatura ambiente durante la sesión de la inyección. </li></ol> B. La fabricación de pipetas de inyección <ol><li> Pipetas desechables microinyección de vidrio están disponibles comercialmente (por ejemplo, Femtotips, Eppendorf), que son convenientes, pero caro ($ 10 por pipeta de microinyección). Pipetas de inyección se pueden fabricar en el laboratorio usando un P-97 programable extractor Flaming pipeta Brown (Empresa Sutter Instrument, Novato, CA) y filamented, de paredes delgadas tubos capilares de borosilicato (Instrumentos del Mundo de precisión, Sarasota, FL). Esta opción es más rentable y permite el control de la forma y el tamaño de pipeta de microinyección. </li><li> Un programa de dos etapas se utiliza para tirar estrechas puntas de pipeta de microinyección. Desde la apertura de pipetas de microinyección es demasiado estrecho para examinarla bajo el microscopio de luz, la calidad de las pipetas de inyección tienen que ser evaluadas directamente mediante la inyección de unas pocas células antes de la configuración del programa se finalicen. Los siguientes son los valores aproximados para los ajustes de calor, la atracción, la velocidad y el tiempo: (la 1) 600, 115, 15, 250, (pull 2) 640, 130, 65, 200. Estos valores varían con diferentes lotes de vidrio y por la condición de que el filamento de calentamiento en el extractor, y debe ajustarse según sea necesario. Para más detalles véase el punto 5. </li><li> Tire de varias (2-5) pipetas de inyección por plato de neuronas que se inyecta, en caso de daños o problemas durante la sesión de la inyección. Tienda de pipetas de inyección en un recipiente tapado para evitar que entre polvo en la punta de la pipeta de microinyección. </li></ol> II. Microinyección intranucleares tienda de campaña &quot;&gt; En esta sección se detalla el proceso de inyección de cDNA en el núcleo de las neuronas. Una microinyección de configuración básica incluye una fase invertida microscopio de contraste (por ejemplo, Nikon Diaphot TMD, Nikon, Melville, NY) para visualizar el proceso, micromanipulador (por ejemplo, Eppendorf 5171) para controlar el movimiento de la pipeta de inyección y una presión de inyección (por ejemplo, Eppendorf FemtoJet Express) para expulsar a la solución de cDNA a partir de la pipeta. Conexión de la presión de inyección para el micromanipulador permite la sincronización de los dos últimos procesos durante las inyecciones. Otros opcional, pero altamente recomendable, componentes incluyen un sistema de video vigilancia montado (cámara CCD, Cohu Inc., San Diego, CA, en blanco y negro monitor de vídeo, Sony Corporation, Tokio, Japón). Este sistema no es un requisito absoluto para inyecciones; Sin embargo, el monitor en blanco y negro ofrece un alto contraste para una mejor visualización del núcleo celular y ofrece una experiencia de visualización más cómoda durante las sesiones de inyección de largo. Además, un ordenador portátil con software para operar un controlador de mano se puede utilizar para semi- automatizar el proceso de inyección (véase la discusión para más detalles). El momento ideal para inyectar las neuronas SCG es de 3-6 horas después de la disociación. En esta etapa, las células son esféricas, muy bien fijadas a la parte inferior del plato, y el núcleo es claramente visible, con un microscopio de contraste de fase, como un centro de orgánulos ronda con una membrana oscura, que contiene una sola o múltiples nucleolos (Figura 1A). <ol><li> Coloque un plato de neuronas disociadas en el centro de la platina del microscopio. Ajustar el enfoque y optimizar la óptica de contraste de fase del microscopio de modo que el núcleo de las neuronas son claramente visibles. </li><li> Pipeta de 2 l de solución preparada cDNA en una pipeta de microinyección con una punta de pipeta microloader. Que elaborar una solución en la parte inferior del tubo de hematocrito, ya que podría despertar las partículas que se establecieron durante la centrifugación. El filamento de la pipetas de microinyección debe ayudar en la elaboración de una solución a la punta, pero si persisten las pequeñas burbujas de aire, dé golpecitos en el lado del vidrio para desalojarlos. </li><li> Inserte la pipeta de microinyección en el titular de la presión capilar de inyección y asegurar el soporte para el micromanipulador. El soporte se fija en un ángulo de 45 °. </li><li> Baje la pipeta de microinyección en el plato. A medida que la pipeta entre en el medio de cultivo, el menisco se forma que afecta a la refracción de la luz y reduce la calidad de la imagen de las neuronas. Para aliviar este problema, la torre del anillo de fase puede ser ligeramente desplazado hasta el núcleo de las neuronas son claramente visibles de nuevo. </li><li> Algunos sistemas de inyección a alta presión tienen una &quot;limpia&quot; la función que se aplica la presión máxima del aire de la punta de la pipeta de microinyección de un corto período. Utilice esta función para borrar la pipeta de escombros antes de comenzar y durante las inyecciones si la punta aparece tapado. Si el líquido disipado no es visible en la pantalla mientras se utiliza esta función, vuelva a colocar con una pipeta nueva inyección. </li><li> El centro de la pipeta de microinyección en el monitor de visualización y alinear la punta al lado de una neurona y en el mismo plano focal que el nucléolo. Establecer esta posición como la más baja del eje z límite en el micromanipulador. Esta posición es la profundidad de la pipeta de microinyección avanzarán a durante las inyecciones. Ahora la posición de la punta de unos 30 m por encima de este punto para la pipeta de microinyección elimina la parte superior de las neuronas. </li><li> El &quot;inyectar&quot; el modo de un micromanipulador Eppendorf 5171 se puede definir con los siguientes valores para realizar inyecciones intranucleares. La función de inyectar está activada, mientras que la función es atravesar la dejó. Un camino de inyección de diagonal (a lo largo del X y Z) produce la menor cantidad de daño celular, y por lo tanto el modo axial se debe utilizar para preparaciones inyectables. Una velocidad de inyección de 300 m / s es suficiente, y sincronizar la acumulación de presión cuando la pipeta de microinyección alcanza el conjunto del eje z límite. </li><li> La presión de inyección controla la cantidad de solución de cDNA se inyecta en el núcleo. En el modo &quot;automático&quot; de la inyección, la entrega de ADN es controlada en el tiempo e iniciado por el micromanipulador conectado. La presión de inyección (Pi) se debe establecer entre 100 a 200 hectopascales (hPa, 1 hPa ~ 0,015 psi); mayores presiones de inyección no mejoran las tasas de éxito o la calidad de las inyecciones y puede indicar otros problemas con el tamaño de la microinyección de ADN punta de la pipeta o la pureza . Una duración de la inyección (TI) de 0,3 s y una compensación de presión (Pc), de 30 hPa, que suministra una presión positiva constante para evitar la entrada de oclusión de las partículas del medio de cultivo en la punta de la pipeta, se debe utilizar. </li><li> Posición de la neurona que se inyecta debajo de la punta de la pipeta de microinyección con el microscopio de xy el eje de control de la etapa. Alinee la punta de la pipeta por encima del centro del núcleo, centrándose ida y vuelta entre tque la punta y el nucléolo. </li><li> Inyectar el núcleo pulsando el botón de inyección (en el micromanipulador). Para el paso de la inyección, el movimiento de la pipeta de microinyección y el lanzamiento de la solución de cDNA son controlados por el micromanipulador. Es difícil confirmar el éxito inyecciones intranucleares a ojo, pero la inyección de la solución de viscosidad relativamente baja cDNA (en comparación con el medio ambiente nuclear viscoso), a menudo aparece como un penacho blanco bajo la óptica de contraste de fase y se puede utilizar como un indicador de inyección en el núcleo. A veces la pipeta de microinyección no penetra en la membrana nuclear y simplemente empuja el núcleo. Un intento de la segunda inyección en la misma posición puede conducir a un éxito de la inyección de ADN en el núcleo. Hinchazón de la célula es generalmente indicativo de la inyección citoplasmática no intencional. Además, la hinchazón significativa nuclear no es bien tolerado por las neuronas y generalmente resulta en la muerte celular poco después, por lo que la presión de inyección y la duración no debe superar los valores sugeridos. </li><li> Continuar inyectando neuronas mediante el reposicionamiento de la platina del microscopio para alinear la siguiente neurona en la pipeta de microinyección. Sistemáticamente navegar a través de la antena para inyectar aproximadamente 50 a 100 núcleos antes de devolver el plato de las neuronas a la incubadora de incubación durante la noche. Neuronas con éxito inyectada puede ser identificado al día siguiente por la expresión del gen reportero. </li></ol> III. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/1614/1614fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: ganglio cervical superior (SCG), las neuronas. La imagen de contraste de fase de las neuronas SCG 3 horas después de la disociación (A). En esta etapa, el núcleo se ve claramente que ayuda a la alineación de la punta de la pipeta de microinyección. El núcleo aparece en el centro de las neuronas con una sola (izquierda) o múltiples (derecha) nucleolos oscuros. SCG neuronas 16 horas después de la inyección de EGFP cDNA en el núcleo (B). Izquierda, SCG neuronas se observa bajo la iluminación de contraste de fase. Derecha, imagen de epifluorescencia de las mismas neuronas que muestra la inyección con éxito y que resulta la expresión EGFP en una neurona. Barra blanca escala es de 20 micras. <img src="/files/ftp_upload/1614/1614figure2tmb.jpg" alt="Figura 2" border="0" /> Figura 2: Plenario de células grabaciones de las corrientes a través de heteróloga-expresado acoplados a proteína G por dentro rectificación de K + (GIRK) canales de las neuronas SCG. GIRK corrientes (I GIRK) fueron evocados por una rampa de voltaje de 200 ms -140 a 40 mV desde un potencial de mantenimiento de -60 mV (en el recuadro de la A) tras la activación endógena de α 2-adrenérgicos de norepinefrina (NE, 10 M) . Huellas superpuestas son las grabaciones de la misma neurona e indicar antes (negro) y después de la aplicación de cualquiera de NE solo (azul) o NE más de 10 mM Ba 2 + (rojo). Las líneas discontinuas indican el nivel actual de cero. Para la grabación de I GIRK, la solución externa que contiene (en mM) 130 NaCl, 5,4 KCl, 10 HEPES, 10 de CaCl 2, 0,8 MgCl 2, 15 glucosa, sacarosa 15, y 0,0003 TTX, ajustada a pH 7,4 con NaOH. La solución de grabación interna contenía (en mM) 135 KCl, 11 EGTA, 1 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 4 MgATP, y el 0,3 Na 2 GTP, ajustado a pH 7,2 con KOH. La falta de corriente provocada por la rampa de tensión en la presencia de NE en las neuronas SCG no inyectadas (A) demuestra que las neuronas SCG no expresan canales GIRK endógeno. Inyección de éxito de un plásmido que codifica cDNA funcional GIRK canal 11 da lugar a grandes corrientes en la rampa de tensión cuando se expone al NE (B, izquierda). Corrientes tienen las características típicas de las corrientes a través de canales GIRK: la activación de un agonista de los receptores acoplados a proteína G (NE), rectificación hacia adentro, y el bloque de corrientes por el bloqueador del canal GIRK supuesto, Ba 2 + (B, derecha trazo rojo). Los círculos vacíos y llenos representan I GIRK en la explotación y el pico de corriente, respectivamente. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1614/1614figure2.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 2.

<ol>
	<li>Eccles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+potential+of+the+superior+cervical+ganglion.">The action potential of the superior cervical ganglion.</a> J Physiol. 85, 179-206 (1935).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+modulation+of+N-type+calcium+channels+by+G-protein+&#x03B2;&#x03B3;+subunits.">Voltage-dependent modulation of N-type calcium channels by G-protein &#x03B2;&#x03B3; subunits.</a> Nature. 380, 255-258 (1996).</li><li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons.">Potassium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Brain Res. 485, 205-214 (1989).</li><li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+and+calcium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons.">Sodium and calcium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Pflugers Arch. 411, 481-490 (1988).</li><li>Dean, D. A., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Live Cell Imaging: a Laboratory Manual. 1, 51-66 (2005).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+receptors+and+signaling+proteins+in+adult+mammalian+sympathetic+neurons+by+microinjection.">Heterologous expression of receptors and signaling proteins in adult mammalian sympathetic neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 83, 191-202 (1997).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+G-protein+signaling+components+in+adult+mammalian+neurons+by+microinjection.">Expression of G-protein signaling components in adult mammalian neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 259, 167-181 (2004).</li><li>Ikeda, S. R., Jeong, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RGS-insensitive+G&#x03B1;+subunits+to+study+endogenous+RGS+protein+action+on+G-protein+modulation+of+N-type+calcium+channels+in+sympathetic+neurons..">Use of RGS-insensitive G&#x03B1; subunits to study endogenous RGS protein action on G-protein modulation of N-type calcium channels in sympathetic neurons..</a> Methods Enzymol. 389, 170-189 (2004).</li><li>Washbourne, P., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+gene+transfer+into+neurons.">Techniques for gene transfer into neurons.</a> Curr Opin Neurobiol. 12, 566-573 (2002).</li><li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microinjection+technology+in+cell+biology.">Single-cell microinjection technology in cell biology.</a> Bioessays. 30, 606-610 (2008).</li><li>Vivaudou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+G-protein+regulation+of+GIRK1+and+GIRK4,+the+two+subunits+of+the+KACh+channel,+using+functional+homomeric+mutants.">Probing the G-protein regulation of GIRK1 and GIRK4, the two subunits of the KACh channel, using functional homomeric mutants.</a> J Biol Chem. 272, 31553-31560 (1997).</li></ol>

Problemas comunes y sugerencias: Como se mencionó anteriormente inyecciones, nuclear éxito dependerá de que las células adheridas a las placas de cultivo de tejidos. Aplazar el inicio de las inyecciones de un par de horas después del procedimiento de disociación de células permite que las neuronas se adhieren al fondo de los platos. Además, platos con revestimiento de 0,1 mg / ml de alto peso molecular de poli-L-lisina (Sigma, St. Louis, MO) la adhesión de las neuronas ayudas a la superficie inferior de los platos. La obstrucción de pipetas de microinyección, especialmente cuando se trata de inyectar una alta concentración de ADN, puede ser un problema frecuente. Con alta calidad de las columnas de separación para aislar y purificar el ADN plásmido, y la realización de las etapas de purificación adicionales que se mencionan (filtros de giro, girar en los tubos de hematocrito) puede ayudar a eliminar las partículas antes de la inyección. Durante las inyecciones, la &quot;limpia&quot; en función de la presión de inyección se pueden utilizar (por 0,2 s es suficiente), pero si eso no resuelve el problema, una pipeta nueva inyección debe ser utilizado. Si la mayoría de las pipetas de microinyección se tapan durante una sesión de inyección, considerar la modificación de la configuración del extractor pipeta de vidrio para producir puntas de pipeta de microinyección con una abertura más grande. Otra cuestión que se plantea durante las inyecciones nuclear es la irregularidad de la superficie inferior de placas de cultivo de tejidos. Esta variabilidad afecta directamente a la precisión de la focalización de las puntas de pipeta de inyección para el núcleo ya que la profundidad de la pipeta atraviesa durante las inyecciones es fijo. Por lo tanto, este límite del eje z debe ser ajustado durante el curso de las inyecciones en el mismo plato. Será evidente que un ajuste es necesario: no habrá ninguna indicación de la inyección nuclear (no penacho blanco en el núcleo de la célula o se pierde por completo), o la punta de la pipeta de inyección se aproxima a la parte inferior de la placa (la compresión de la célula o incluso chocar la punta de la pipeta en el fondo del plato). La clonación de vidrio cilindros (. OD 10 mm, Cat. N º 2090-01010, Bellco Glass, Vineland, NJ) se puede utilizar durante el forro de las neuronas para restringir en una más pequeña, la zona más limitada, por lo que minimiza la distancia necesaria para mover la pipeta de inyección entre las inyecciones. Estos cilindros de clonación se retiran antes de realizar microinyecciones. Inconvenientes de la técnica: Microinyecciones intranucleares son técnicamente exigentes, que requieren paciencia y un alto grado de destreza manual por el operador. Capacidad con esta técnica, al igual que con cualquier otra habilidad, viene con la práctica. Por lo tanto, se aconseja la práctica de inyecciones nuclear del gen reportero solo antes de intentar experimentos reales. Para ayudar aún más el proceso de inyección, puede ser posible para consolidar los pasos del micromanipulador y la presión de inyección en un programa de ordenador. Programas como Igor Pro (WaveMetrics, Lake Oswego, Oregón) puede ser utilizada para almacenar la configuración de microinyección y programar los controladores multifuncionales (SHUTTLEPRO, Contour Design, Windham, Nueva Hampshire) para semi-automatizar el proceso de inyección (ver 6,7,8 para más detalles). Otro de los inconvenientes de la técnica de microinyección intranucleares es la baja tasa de éxito. Aproximadamente el 10-20% de los intentos de inyecciones nuclear conducen a la expresión de proteínas. Mientras que la eficacia puede ser suficiente para las aplicaciones que no requieren un gran número de células que expresan, la electrofisiología, por ejemplo, para varios ensayos bioquímicos esto puede no ser suficiente. Aplicaciones de la técnica: A pesar de sus inconvenientes, la microinyección de ADN intranuclear es una técnica extremadamente útil para heteróloga la expresión de proteínas en las neuronas. Los altos niveles de expresión de la proteína se logra con microinyecciones nuclear debido a la gran cantidad de plásmidos liberado en el núcleo durante las inyecciones, un promotor de CMV de gran actividad que regula la transcripción de genes, y la estabilidad a largo de los plásmidos en el núcleo. La sobre-expresión de proteínas es especialmente útil en el dominante negativo de los experimentos en los altos niveles de proteínas heterólogas están obligados a abrumar a la proteína endógena. Otra de las ventajas de las inyecciones intranucleares es la capacidad de entregar una parte consistente de las construcciones de cDNA para el núcleo que construye múltiples son inyectados. Con los métodos de transfección otra parte, es difícil introducir reproducible en la misma proporción de cada constructo de ADN en las células diferentes en el mismo plato y entre las transfecciones. Inyección directa de la solución de cDNA en el núcleo elimina esta fuente de variabilidad y permite que la proporción de proteínas que se expresan a titularse con eficacia. Los métodos tradicionales tienen una eficacia limitada de la transfección en células post-mitóticas por baja incorporación de ADN en el núcleo 9 y la toxicidad química asociada con Reag transfecciónlos padres 10. Microinyecciones nuclear superar estos problemas mediante la introducción de material genético mecánica en el núcleo. Aunque esta técnica es más compleja, la capacidad de estudiar el efecto de una proteína en un sistema biológico funcional, con las vías de señalización endógena, más que compensa el carácter laborioso de esta técnica. Todos los procedimientos experimentales en animales se realizaron de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de las Directrices para el Cuidado de Animales y el empleo.

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ultrafree-MC Filter Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC30VV00</td>
<td>Durapore PVDF filter; 0.1 &mu;m pore-size</td>
</tr>
<tr>
<td>TE buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Quality Biological, Inc</td>
<td>351-010-131</td>
<td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro-hematocrit capillary tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22-362-574</td>
<td>Unheparinized Preparation: 
Soak in 100% ethanol overnight. Wash thoroughly with deionized water three times and dry bake glass in an oven (95&deg;C). Cut the cleaned hematocrit tubes into 3-4 cm length pieces using a diamond-tipped scriber, and seal one end closed with a flame and forceps to hold the glass. Store in a clean glass beaker and cover to prevent dust build-up. </td>
</tr>
<tr>
<td>Microcentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5417 R</td>
<td>With a fixed angle or swinging-bucket rotor</td>
</tr>
<tr>
<td>Microloader 20 &mu;l pipet tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242 956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection capillary glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW120F-4</td>
<td>Thin-walled with filament, 1.2 mm outer-diameter, 0.9 mm inner-diameter, 100 mm length</td>
</tr>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P-97</td>
<td>With platinum-iridium box filament (part # FB330B)</td>
</tr>
<tr>
<td>Nikon Diaphot TMD Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>20x and 40x phase-contrast objective lenses, mounted on a vibration isolation table</td>
</tr>
<tr>
<td>Charge-coupled device (CCD) camera </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cohu Inc.</td>
<td>6410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Video monitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sony Corporation</td>
<td>PVM-122</td>
<td>Black and White, 9&#x201D; screen </td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5171</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>FemtoJet Express</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Contour Design</td>
<td>S-PROV2</td>
<td>Programmable multimedia controller</td>
</tr>
<tr>
<td>Igor Pro</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WaveMetrics</td>
<td>Version 4.05A</td>
<td>Command program to control the microinjection controller written by S. Ikeda</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

intranuclear microinjection of dna into dissociated adult mammalian neurons

Cultivos primarios de células neuronales son herramientas valiosas para estudiar la función de la proteína, ya que representan un sistema biológicamente más relevantes, en comparación a las líneas de células inmortalizadas. Sin embargo, la naturaleza post-mitótica de las neuronas primarias impide la expresión efectiva de proteínas heterólogas utilizando procedimientos comunes como la electroporación o la transfección mediada químicamente. Así, otras técnicas se deben emplear para expresarse con eficacia las proteínas en estas células no se dividen. En este artículo se describen los pasos necesarios para realizar las inyecciones intranucleares de las construcciones de cDNA en disociar las neuronas simpáticas de adultos. Esta técnica, que se ha aplicado a diferentes tipos de neuronas, con éxito puede inducir la expresión de proteínas heterólogas. El equipo esencial para el procedimiento de microinyección incluye un microscopio invertido para visualizar las células, una pipeta de inyección de vidrio llena con una solución de cDNA que está conectado a un N 2 (g) sistema de suministro de presión, y un micromanipulador. El micromanipulador coordina el movimiento de la inyección de una pipeta de microinyección con un breve pulso de presión de N 2 para expulsar solución de cDNA a partir de la punta de la pipeta. Esta técnica no tiene la toxicidad asociada con muchos otros métodos de transfección y permite múltiples constructos de ADN que se expresa en una proporción constante. El bajo número de células inyectadas hace que el procedimiento de microinyección muy adecuado para estudios de células individuales, tales como registros electrofisiológicos y de imagen óptica, pero puede no ser ideal para los ensayos bioquímicos que requieren un mayor número de células y una mayor eficiencia de transfección. A pesar de microinyecciones intranucleares requerirá una inversión de equipo y el tiempo, la capacidad de alcanzar altos niveles de expresión de proteínas heterólogas en un ambiente fisiológicamente relevantes hace que esta técnica una herramienta muy útil para investigar la función de proteínas.

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Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Inyección directa intranucleares de cDNA es una técnica eficaz para la transfección las células post-mitóticas. Este método proporciona altos niveles de expresión de proteínas heterólogas de construcciones de ADNc únicos o múltiples y permite la función de proteínas a estudiar en un ambiente fisiológicamente relevantes con una variedad de ensayos de células individuales.

La microinyección de ADN en intranucleares disociada neuronas de mamíferos adultos

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.8K vistas.  National Institutes of Health (NIH). Inyección directa intranucleares de cDNA es una técnica eficaz para la transfección las células post-mitóticas. Este método proporciona altos niveles de expresión de proteínas heterólogas de construcciones de ADNc únicos o múltiples y permite la función de proteínas a estudiar en un ambiente fisiológicamente relevantes con una variedad de ensayos de células individuales.

Video: Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Preparación de los cultivos disociados ratón neuronas corticales

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Investigación

Biología

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

La transfección de ADN de músculos esqueléticos de mamíferos con En Vivo La electroporación

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

El análisis de ADN de doble cadena Break (OSD) de reparación en células de mamífero

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Inyección intraperitoneal en adultos de pez cebra

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Análisis de la cinética de exportación nuclear de ARNm en células de mamífero por microinyección

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

El análisis de la función de las pequeñas GTPasas de la microinyección de plásmidos en células epiteliales polarizadas

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

El trasplante de células directamente en el riñón de adultos de pez cebra

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la retina de pez cebra adultos

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

La diferenciación eficiente de las células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic knockdown system, we showed novel functions for HDAC1,2 in replication fork progression and nascent chromatin maintenance in mammalian cells. Additionally, we used a BrdU-ChIP-Slot-Western technique that combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) of bromo-deoxyuridine (BrdU)-labeled DNA with slot blot and Western analyses to quantitatively measure proteins or histone modification associated with nascent DNA.
Actively dividing cells were treated with HDAC1,2 selective inhibitor or transfected with siRNAs against Hdac1 and Hdac2 and then newly synthesized DNA was labeled with the thymidine analog bromodeoxyuridine (BrdU). The BrdU labeling was done at a time point when there was no significant cell cycle arrest or apoptosis due to the loss of HDAC1,2 functions. Following labeling of cells with BrdU, chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone acetylation marks or the chromatin-remodeler was performed with specific antibodies. BrdU-labeled input DNA and the immunoprecipitated (or ChIPed) DNA was then spotted onto a membrane using the slot blot technique and immobilized using UV. The amount of nascent DNA in each slot was then quantitatively assessed using Western analysis with an anti-BrdU antibody. The effect of loss of HDAC1,2 functions on the levels of newly synthesized DNA-associated histone acetylation marks and chromatin remodeler was then determined by normalizing the BrdU-ChIP signal obtained from the treated samples to the control samples.

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.