Estamos llevando a cabo investigaciones en genómica funcional con un enfoque en la identificación y caracterización de los elementos funcionales dentro del genoma humano. Nuestro principal interés es explorar la parte del genoma que aún no ha sido bien asignada para comprender mejor sus posibles funciones y cómo podrían contribuir a la biología y la enfermedad humanas. Las herramientas actuales de genética inversa tienen algunas limitaciones, como efectos no específicos y un alto costo en la creación de bibliotecas complejas de SSIs o SGIs.
Otro desafío es que este método puede dirigirse solo a los elementos genómicos asignados, lo que deja una gran parte del genoma poco explorada. El protocolo desarrollado aquí ofrece un nuevo enfoque para identificar elementos genómicos previamente desconocidos, incluidos nuevos exones funcionales tanto en la codificación de proteínas como en los ojos de codificación larga. Para empezar, utilice el ADN genómico aislado de una biblioteca de células de mutagénesis insercional basada en lentivirus como plantilla para una PCR lineal en una reacción de 50 microlitros. Entonces.
agregue los otros reactivos necesarios que se muestran aquí en el tubo de PCR. Realice 50 ciclos de PCR lineal en un termociclador estándar en las condiciones de PCR dadas. Transfiera los productos de PCR a un nuevo tubo de centrífuga limpio de 1,5 mililitros.
Mezclar bien los productos de PCR con 10 microlitros de perlas magnéticas de biotina-estreptavidina e incubar la mezcla durante dos horas a temperatura ambiente, agitando a 400 RPM en un baño de metal. Luego, use un soporte magnético para recoger las cuentas y retire con cuidado el sobrenadante. Lave las cuentas con 300 microlitros de tampón de unión o lavado seis veces, desechando el sobrenadante después de cada lavado.
Para la síntesis de la segunda hebra, vuelva a suspender las perlas en un volumen de reacción de 24 microlitros que contenga tampón de fragmentos Klenow, mezcla de DNTP y cebador P5N6 en un tubo de PCR. Preincubar la mezcla a 15 grados centígrados durante 20 minutos en un termociclador de PCR, luego agregar dos unidades de fragmento de Klenow a la mezcla de reacción. Incubar las mezclas en un termociclador de PCR en las condiciones dadas.
A continuación, transfiera los productos de PCR a un nuevo tubo de centrífuga limpio de 1,5 mililitros. Use un soporte magnético para capturar las cuentas y desechar el sobrenadante. Después de eso, lave las perlas suavemente con 300 microlitros de agua destilada sin DNasa y RNasa a cuatro grados centígrados.
Recoge las cuentas y desecha el sobrenadante. Vuelva a suspender las perlas en un volumen de reacción de PCR de 25 microlitros que contenga tampón Taq, ADN polimerasa Taq, cebador P5, mezcla de DNTP y cebador 3-LTR_Nest en un tubo de PCR. Realice la PCR en un termociclador con los ajustes que se muestran aquí.
Utilice cinco microlitros de los productos de PCR como plantilla para la siguiente ronda de reacción de PCR con el cebador Illumina P5 y el cebador Illumina P73-LTR. Realice la PCR en un termociclador en las condiciones dadas. A continuación, transfiera los productos de PCR a un tubo de centrífuga limpio de 1,5 mililitros.
Después de equilibrar las cuentas de dos a ocho grados centígrados a temperatura ambiente durante 30 minutos, mezcle bien las cuentas invirtiendo o en vórtice. Pipetee 1,2 veces el volumen de las perlas en un tubo de centrífuga limpio de 1,5 mililitros. Agregue los productos de PCR a las perlas y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces.
Incuba las perlas para permitir que el ADN se una a ellas. A continuación, coloque las muestras en un soporte magnético y retire el sobrenadante una vez que la solución esté clara. Ahora, lave las perlas con 200 microlitros de etanol al 80%.
Incubar a temperatura ambiente durante 30 segundos y retirar el sobrenadante. Seque las cuentas al aire libre a temperatura ambiente con la tapa abierta durante aproximadamente cinco minutos. Ahora, retire el tubo del soporte magnético.
Añadir 22 microlitros de agua destilada libre de DNasa y RNasa. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces y déjelo reposar a temperatura ambiente durante dos minutos. Vuelva a colocar el tubo en el soporte magnético hasta que la solución esté clara.
A continuación, transfiera 21 microlitros del sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio de 1,5 mililitros. Para medir la concentración con el fluorómetro, prepare la solución de trabajo mezclando el reactivo y el tampón en una proporción de uno a 200. Mezcle 10 microlitros de estándar uno y 10 microlitros de estándar dos, cada uno con 190 microlitros de solución de trabajo, para preparar los estándares de ensayo.
Agita suavemente las mezclas durante dos o tres segundos. A continuación, prepare la muestra de ensayo mezclando un microlitro de los productos de PCR purificados con 199 microlitros de solución de trabajo. Agita suavemente la mezcla durante dos o tres segundos.
Incube los patrones de ensayo y las muestras de ensayo durante dos minutos a temperatura ambiente, manteniéndolos protegidos de la luz, luego encienda el fluorímetro. Seleccione el programa de ensayo de alta sensibilidad de ADN bicatenario en el menú principal. Para la calibración, inserte el estándar uno en la máquina y presione el botón de lectura del estándar para medir el primer estándar.
A continuación, inserte el estándar dos y presione el botón de lectura de estándar para medir el segundo estándar. Para la medición de muestras, presione el botón ejecutar muestras para ir a la página de medición de muestras. Inserte cada tubo que contenga la muestra de ensayo y presione el botón de lectura del tubo para obtener la concentración.
En la muestra de baja calidad, un pico dominante alrededor de 83 pares de bases indica contaminación del dímero adaptador. Por el contrario, la biblioteca NGS de alta calidad muestra picos principales entre 150 y 1.500 pares de bases, lo que refleja el perfil de una biblioteca exitosa.
