우리는 인간 게놈 내의 기능적 요소를 식별하고 특성화하는 데 중점을 두고 기능 유전체학 연구를 수행하고 있습니다. 우리의 주요 관심사는 게놈의 잠재적인 역할과 인간 생물학 및 질병에 어떻게 기여할 수 있는지 더 잘 이해하기 위해 아직 잘 할당되지 않은 게놈 부분을 탐구하는 것입니다. 현재의 역 유전학 도구는 SSI 또는 SGI의 복잡한 라이브러리를 만드는 데 비특이적 효과 및 높은 비용과 같은 몇 가지 제한 사항이 있습니다.
또 다른 문제는 이 방법이 할당된 게놈 요소만 표적으로 삼아 게놈의 많은 부분을 충분히 탐색하지 못할 수 있다는 것입니다. 여기에서 개발된 프로토콜은 단백질 코딩과 긴 코딩 눈 모두에서 새로운 기능성 엑손을 포함하여 이전에 알려지지 않은 게놈 요소를 식별하기 위한 새로운 접근 방식을 제공합니다. 먼저 렌티바이러스 기반 삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리에서 분리된 게놈 DNA를 50마이크로리터 반응에서 선형 PCR의 템플릿으로 사용합니다. 그러면.
PCR 튜브에 여기에 표시된 다른 필수 시약을 추가합니다. 주어진 PCR 조건 하에서 표준 thermocycler에 있는 선형 PCR의 50 주기를 실행하십시오. PCR 산물을 깨끗한 새 1.5ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
PCR 산물을 10마이크로리터의 비오틴-스트렙타비딘 마그네틱 비드와 철저히 혼합하고 금속 수조에서 400RPM으로 진탕하면서 실온에서 2시간 동안 혼합물을 배양합니다. 그런 다음 마그네틱 스탠드를 사용하여 비드를 모으고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 300 마이크로 리터의 바인딩으로 비드를 세척하거나 완충액을 6 번 세척하고 각 세척 후에 상층액을 버리십시오.
두 번째 가닥 합성의 경우, PCR 튜브에 Klenow 단편 완충액, DNTP 혼합물 및 P5N6 프라이머를 포함하는 24마이크로리터 반응 부피에서 비드를 재현탁합니다. PCR thermocycler에서 20분 동안 섭씨 15도에서 혼합물을 사전 배양한 다음 반응 혼합물에 두 단위의 Klenow 단편을 추가합니다. 주어진 조건 하에서 PCR thermocycler에 있는 혼합물을 배양하십시오.
그런 다음 PCR 산물을 깨끗한 새 1.5ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 마그네틱 스탠드를 사용하여 비드를 잡고 상층액을 버립니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 300마이크로리터의 DNase 및 RNase가 없는 증류수로 비드를 부드럽게 세척합니다.
비드를 모으고 상층액을 버립니다. PCR 튜브에 Taq 완충액, Taq DNA 중합효소, 프라이머 P5, DNTP 혼합물 및 프라이머 3-LTR_Nest를 포함하는 25마이크로리터 PCR 반응 부피에 비드를 재현탁합니다. 여기에 표시된 설정으로 thermocycler에서 PCR을 수행합니다.
5마이크로리터의 PCR 산물을 프라이머 Illumina P5 및 프라이머 Illumina P73-LTR을 사용한 다음 PCR 반응의 주형으로 사용합니다. 주어진 조건 하에서 thermocycler에 있는 PCR를 실행하십시오. 그런 다음 PCR 산물을 깨끗한 1.5ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
구슬을 섭씨 2도에서 8도에서 실온까지 30분 동안 평형을 이룬 후 반전 또는 와류로 구슬을 철저히 혼합합니다. 비드 부피의 1.2배를 깨끗한 1.5ml 원심분리기 튜브에 피펫으로 넣습니다. PCR 산물을 비드에 첨가하고 위아래로 10회 피펫팅하여 철저히 혼합합니다.
DNA가 구슬에 결합할 수 있도록 구슬을 배양합니다. 그런 다음 샘플을 마그네틱 스탠드에 놓고 용액이 투명해지면 상등액을 제거합니다. 이제 200 마이크로 리터의 80 % 에탄올로 비드를 씻으십시오.
실온에서 30초 동안 배양하고 상층액을 제거합니다. 뚜껑을 열고 약 5분 동안 실온에서 구슬을 자연 건조합니다. 이제 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거합니다.
22마이크로리터의 DNase 및 RNase가 없는 증류수를 추가합니다. 피펫팅을 위아래로 10회 하여 철저히 혼합하고 실온에서 2분 동안 그대로 둡니다. 용액이 깨끗해질 때까지 튜브를 마그네틱 스탠드에 다시 놓습니다.
그런 다음 21마이크로리터의 상등액을 깨끗한 1.5ml 원심분리기 튜브에 옮깁니다. 형광측정기로 농도를 측정하려면 시약과 완충액을 1:200 비율로 혼합하여 작업 용액을 준비합니다. 10마이크로리터의 표준 1과 10마이크로리터의 표준 2를 각각 190마이크로리터의 작업 용액과 혼합하여 분석 표준물질을 준비합니다.
2-3초 동안 혼합물을 부드럽게 소용돌이치십시오. 다음으로, 1마이크로리터의 정제된 PCR 산물을 199마이크로리터의 작업 용액과 혼합하여 분석 샘플을 준비합니다. 2-3초 동안 혼합물을 부드럽게 소용돌이치게 합니다.
분석 표준물질과 분석 샘플을 실온에서 2분 동안 배양하여 빛으로부터 보호한 다음 형광계를 켭니다. 메인 메뉴에서 double-stranded DNA 고감도 분석 프로그램을 선택합니다. 교정을 위해 표준 표준을 기계에 삽입하고 읽기 표준 버튼을 눌러 첫 번째 표준을 측정합니다.
그런 다음 표준 2를 삽입하고 읽기 표준 버튼을 눌러 두 번째 표준을 측정합니다. s의 경우ample 측정, run s를 누르십시오.ample 측정 페이지로 이동합니다. 분석 샘플이 들어있는 각 튜브를 삽입하고 판독 튜브 버튼을 눌러 농도를 얻습니다.
저품질 샘플에서 83 염기쌍 부근의 우세한 피크는 어댑터 이량체 오염을 나타냅니다. 대조적으로, 고품질 NGS 라이브러리는 150에서 1, 500 염기쌍 사이의 주요 피크를 표시하여 성공적인 라이브러리의 프로필을 반영합니다.
