Stiamo conducendo ricerche nel campo della genomica funzionale con particolare attenzione all'identificazione e alla caratterizzazione degli elementi funzionali all'interno del genoma umano. Il nostro interesse principale è quello di esplorare le parti del genoma che non sono state ancora ben assegnate per comprendere meglio i loro potenziali ruoli e come potrebbero contribuire alla biologia umana e alle malattie. Gli attuali strumenti di genetica inversa presentano alcune limitazioni, come effetti non specifici e costi elevati nella creazione di librerie complesse di SSI o SGI.
Un'altra sfida è che questo metodo può mirare solo agli elementi genomici allocati, lasciando una grande parte del genoma inesplorata. Il protocollo qui sviluppato offre un nuovo approccio per l'identificazione di elementi genomici precedentemente sconosciuti, inclusi nuovi esoni funzionali sia negli occhi codificanti per proteine che in quelli codificanti lunghi. Per iniziare, utilizzare il DNA genomico isolato da una libreria di cellule di mutagenesi inserzionale basata su lentivirus come modello per una PCR lineare in una reazione da 50 microlitri. Allora.
aggiungere gli altri reagenti necessari mostrati qui nella provetta per PCR. Eseguire 50 cicli di PCR lineare in un termociclatore standard nelle condizioni di PCR date. Trasferire i prodotti PCR in una nuova provetta da centrifuga pulita da 1,5 millilitri.
Miscelare accuratamente i prodotti della PCR con 10 microlitri di biglie magnetiche di biotina-streptavidina e incubare la miscela per due ore a temperatura ambiente, agitando a 400 RPM in un bagno di metallo. Quindi, utilizzare un supporto magnetico per raccogliere le perline e rimuovere con cura il surnatante. Lavare le perle con 300 microlitri di legante o tampone di lavaggio sei volte, scartando il surnatante dopo ogni lavaggio.
Per la sintesi del secondo filamento, risospendere le perle in un volume di reazione di 24 microlitri contenente tampone di frammenti Klenow, miscela DNTP e primer P5N6 in una provetta per PCR. Pre-incubare la miscela a 15 gradi Celsius per 20 minuti in un termociclatore PCR, quindi aggiungere due unità di frammento di Klenow alla miscela di reazione. Incubare le miscele in un termociclatore per PCR nelle condizioni date.
Quindi, trasferire i prodotti PCR in una nuova provetta da centrifuga pulita da 1,5 millilitri. Utilizzare un supporto magnetico per catturare le perline e scartare il surnatante. Successivamente, lavare delicatamente le perle con 300 microlitri di DNasi e acqua distillata priva di RNasi a quattro gradi Celsius.
Raccogli le perline e scarta il surnatante. Risospendere le perle in un volume di reazione PCR da 25 microlitri contenente tampone Taq, Taq DNA polimerasi, primer P5, miscela DNTP e primer 3-LTR_Nest in una provetta per PCR. Eseguire la PCR in un termociclatore con le impostazioni mostrate qui.
Utilizzare cinque microlitri di prodotti PCR come modello per il successivo ciclo di reazione PCR con il primer Illumina P5 e il primer Illumina P73-LTR. Eseguire la PCR in un termociclatore nelle condizioni date. Quindi, trasferire i prodotti PCR in una provetta da centrifuga pulita da 1,5 millilitri.
Dopo aver bilanciato le perle da due a otto gradi Celsius a temperatura ambiente per 30 minuti, mescolare accuratamente le perle invertendole o vorticandole. Pipettare 1,2 volte il volume delle perle in una provetta da centrifuga pulita da 1,5 millilitri. Aggiungere i prodotti PCR alle perle e mescolare accuratamente pipettando su e giù 10 volte.
Incubare le perle per consentire al DNA di legarsi ad esse. Quindi, posizionare i campioni su un supporto magnetico e rimuovere il surnatante una volta che la soluzione è limpida. Ora, lava le perline con 200 microlitri di etanolo all'80%.
Incubare a temperatura ambiente per 30 secondi e rimuovere il surnatante. Asciugare le perline all'aria a temperatura ambiente con il coperchio aperto per circa cinque minuti. A questo punto, rimuovere il tubo dal supporto magnetico.
Aggiungere 22 microlitri di DNasi e acqua distillata priva di RNasi. Mescolare accuratamente pipettando su e giù 10 volte e lasciare riposare a temperatura ambiente per due minuti. Riposizionare il tubo sul supporto magnetico fino a quando la soluzione non è limpida.
Quindi, trasferire 21 microlitri di surnatante in una provetta da centrifuga pulita da 1,5 millilitri. Per misurare la concentrazione con il fluorimetro, preparare la soluzione di lavoro mescolando il reagente e il tampone in un rapporto di uno a 200. Mescolare 10 microlitri di standard uno e 10 microlitri di standard due, ciascuno con 190 microlitri di soluzione di lavoro, per preparare gli standard di analisi.
Agitare delicatamente le miscele per due o tre secondi. Successivamente, preparare il campione di analisi mescolando un microlitro di prodotti PCR purificati con 199 microlitri di soluzione di lavoro. Agitare delicatamente il composto per due o tre secondi.
Incubare gli standard del saggio e i campioni del saggio per due minuti a temperatura ambiente, mantenendoli al riparo dalla luce, quindi accendere il fluorimetro. Selezionare il programma di saggi ad alta sensibilità del DNA a doppio filamento dal menu principale. Per la calibrazione, inserire quello standard nella macchina e premere il pulsante di lettura dello standard per misurare il primo standard.
Quindi, inserire lo standard due e premere il pulsante di lettura dello standard per misurare il secondo standard. Per la misurazione del campione, premere il pulsante Esegui campioni per accedere alla pagina della misurazione del campione. Inserire ciascuna provetta contenente il campione di analisi e premere il pulsante di lettura della provetta per ottenere la concentrazione.
Nel campione di bassa qualità, un picco dominante intorno a 83 coppie di basi indica la contaminazione del dimero dell'adattatore. Al contrario, la libreria NGS di alta qualità mostra picchi principali compresi tra 150 e 1.500 coppie di basi, riflettendo il profilo di una libreria di successo.
