Wir forschen im Bereich der funktionellen Genomik mit dem Schwerpunkt auf der Identifizierung und Charakterisierung der funktionellen Elemente innerhalb des menschlichen Genoms. Unser Hauptinteresse liegt darin, den Teil des Genoms zu erforschen, der noch nicht gut zugeordnet wurde, um ihre potenzielle Rolle besser zu verstehen und zu verstehen, wie sie zur menschlichen Biologie und Krankheit beitragen könnten. Aktuelle Werkzeuge der reversen Genetik weisen einige Einschränkungen auf, wie z. B. unspezifische Effekte und hohe Kosten bei der Erstellung komplexer Bibliotheken von SSIs oder SGIs.
Eine weitere Herausforderung besteht darin, dass diese Methode möglicherweise nur auf zugeordnete genomische Elemente abzielt, so dass ein großer Teil des Genoms unerforscht bleibt. Das hier entwickelte Protokoll bietet einen neuen Ansatz zur Identifizierung bisher unbekannter genomischer Elemente, einschließlich neuartiger funktioneller Exons sowohl in proteinkodierenden als auch in langkodierenden Augen. Verwenden Sie zunächst genomische DNA, die aus einer Lentivirus-basierten Insertionsmutagenese-Zellbibliothek isoliert wurde, als Vorlage für eine lineare PCR in einer 50-Mikroliter-Reaktion. Dann.
Geben Sie die anderen erforderlichen Reagenzien, die hier gezeigt werden, in das PCR-Röhrchen ein. Führen Sie 50 Zyklen lineare PCR in einem Standard-Thermocycler unter den gegebenen PCR-Bedingungen durch. Übertragen Sie die PCR-Produkte in ein neues, sauberes 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Mischen Sie die PCR-Produkte gründlich mit 10 Mikrolitern magnetischen Biotin-Streptavidin-Kügelchen und inkubieren Sie die Mischung zwei Stunden lang bei Raumtemperatur, wobei Sie sie bei 400 U/min in einem Metallbad schütteln. Verwenden Sie dann einen magnetischen Ständer, um die Kügelchen zu sammeln, und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Waschen Sie die Kügelchen sechsmal mit 300 Mikrolitern Binde- oder Waschpuffer und entsorgen Sie den Überstand nach jedem Waschgang.
Für die Synthese des zweiten Strangs resuspendieren Sie die Kügelchen in einem 24-Mikroliter-Reaktionsvolumen, das Klenow-Fragmentpuffer, DNTP-Mischung und P5N6-Primer in einem PCR-Röhrchen enthält. Inkubieren Sie das Gemisch 20 Minuten lang bei 15 Grad Celsius in einem PCR-Thermocycler vor und geben Sie dann zwei Einheiten Klenow-Fragment in das Reaktionsgemisch. Inkubieren Sie die Mischungen in einem PCR-Thermocycler unter den gegebenen Bedingungen.
Übertragen Sie dann die PCR-Produkte in ein neues, sauberes 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Verwenden Sie einen magnetischen Ständer, um die Kügelchen einzufangen und den Überstand zu entsorgen. Waschen Sie die Kügelchen danach vorsichtig mit 300 Mikrolitern DNase und RNase-freiem destilliertem Wasser bei vier Grad Celsius.
Sammle die Perlen ein und wirf den Überstand weg. Resuspendieren Sie die Kügelchen in einem 25-Mikroliter-PCR-Reaktionsvolumen, das Taq-Puffer, Taq-DNA-Polymerase, Primer P5, DNTP-Mischung und Primer 3-LTR_Nest in einem PCR-Röhrchen enthält. Führen Sie die PCR in einem Thermocycler mit den hier gezeigten Einstellungen durch.
Verwenden Sie fünf Mikroliter der PCR-Produkte als Template für die nächste Runde der PCR-Reaktion mit dem Primer Illumina P5 und dem Primer Illumina P73-LTR. Führen Sie die PCR in einem Thermocycler unter den gegebenen Bedingungen durch. Übertragen Sie dann die PCR-Produkte in ein sauberes 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Nachdem Sie die Kügelchen 30 Minuten lang von zwei bis acht Grad Celsius auf Raumtemperatur ausgeglichen haben, mischen Sie die Kügelchen gründlich, indem Sie sie umdrehen oder vortexen. Pipettieren Sie das 1,2-fache Volumen der Kügelchen in ein sauberes 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie die PCR-Produkte zu den Kügelchen und mischen Sie sie gründlich, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren.
Inkubieren Sie die Kügelchen, damit sich die DNA an sie binden kann. Legen Sie dann die Proben auf einen Magnetständer und entfernen Sie den Überstand, sobald die Lösung klar ist. Waschen Sie nun die Kügelchen mit 200 Mikrolitern 80%igem Ethanol.
30 Sekunden lang bei Raumtemperatur inkubieren und den Überstand entfernen. Trocknen Sie die Kügelchen bei Raumtemperatur bei geöffnetem Deckel etwa fünf Minuten lang an der Luft. Entfernen Sie nun das Rohr vom Magnetständer.
Fügen Sie 22 Mikroliter DNase und RNase-freies destilliertes Wasser hinzu. Mischen Sie gründlich, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren und lassen Sie es zwei Minuten lang bei Raumtemperatur ruhen. Lege das Röhrchen wieder auf den Magnetständer, bis die Lösung klar ist.
Übertragen Sie dann 21 Mikroliter des Überstands in ein sauberes 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Um die Konzentration mit dem Fluorometer zu messen, bereiten Sie die Arbeitslösung vor, indem Sie das Reagenz und den Puffer in einem Verhältnis von eins zu 200 mischen. Mischen Sie 10 Mikroliter Standard eins und 10 Mikroliter Standard zwei mit jeweils 190 Mikrolitern Arbeitslösung, um die Assay-Standards vorzubereiten.
Wirbeln Sie die Mischungen zwei bis drei Sekunden lang sanft ein. Bereiten Sie anschließend die Assay-Probe vor, indem Sie einen Mikroliter der gereinigten PCR-Produkte mit 199 Mikrolitern Arbeitslösung mischen. Wirbeln Sie die Mischung zwei bis drei Sekunden lang vorsichtig ein.
Inkubieren Sie die Assay-Standards und Assay-Proben zwei Minuten lang bei Raumtemperatur, schützen Sie sie vor Licht, und schalten Sie dann das Fluorimeter ein. Wählen Sie das hochempfindliche Assay-Programm für doppelsträngige DNA aus dem Hauptmenü aus. Setzen Sie zur Kalibrierung den Standard eins in die Maschine ein und drücken Sie die Taste zum Ablesen der Norm, um die erste Norm zu messen.
Fügen Sie dann die zweite Norm ein und drücken Sie die Taste "Norm lesen", um die zweite Norm zu messen. Um eine Stichprobenmessung durchzuführen, klicken Sie auf die Schaltfläche Proben ausführen, um zur Seite für die Stichprobenmessung zu gelangen. Setzen Sie jedes Röhrchen mit der Probe ein und drücken Sie die Taste zum Ablesen des Röhrchens, um die Konzentration zu ermitteln.
In der Probe von geringer Qualität deutet ein dominanter Peak um 83 Basenpaare auf eine Kontamination des Adapter-Dimers hin. Im Gegensatz dazu zeigt die hochwertige NGS-Bibliothek Hauptpeaks zwischen 150 und 1.500 Basenpaaren an, was das Profil einer erfolgreichen Bibliothek widerspiegelt.
