El objetivo de mi investigación es obtener la información crítica de confirmación de la beta amiloide 1-40 cuando se absorbe sobre la superficie de la nanopartícula de oro y tiene lugar un proceso de agregación reversible. El reto al que nos enfrentamos en este campo de investigación es obtener información térmica, química y dinámica del proceso de agregación inversa. El gran hallazgo de este proyecto es que somos capaces de identificar el movimiento particular o el modo de vibración que contribuye a la confirmación plegada o desplegada de la beta amiloide 1-40 cuando se absorben sobre la superficie de la nanopartícula de oro.
La gran ventaja de utilizar SERS, espectroscopia de dispersión Raman mejorada en superficie, es detectar señales de dispersión muy pequeñas y débiles para identificar el modo que es crítico para causar el plegamiento y el despliegue. Al mismo tiempo, podemos identificar la morfología de los agregados. Los hallazgos que podemos producir de este proyecto es la interacción clave de la interacción proteína-proteína, que será importante para causar el oligómero y que conducirá a la fibrogénesis.
Para empezar, con una micropipeta, añade un mililitro de agua destilada desionizada a un miligramo de beta amiloide liofilizado, o A beta 1-40. Mezcle la solución con un mezclador de vórtice durante aproximadamente 30 segundos. Asegúrese de que no queden partículas sólidas en la solución a temperatura ambiente, aproximadamente 20 grados centígrados.
A continuación, prepare soluciones madre peptídicas utilizando agua desionizada y destilada. Determine la concentración de péptidos midiendo espectroscópicamente la absorción de tirosina a 275 nanómetros. Almacene las soluciones madre A beta 1-40 a menos 80 grados centígrados.
Descongele la solución madre peptídica aproximadamente cinco minutos antes de la recolección de datos. En un tubo de centrífuga de 15 mililitros, mezcle ocho microlitros de la solución peptídica con 800 microlitros de partículas coloidales de oro. Agregue 4,2 mililitros de agua destilada desionizada, luego agite la muestra durante 10 segundos.
Fije la concentración de péptidos A beta 1-40 en 1,8 nanomolares y ajuste la proporción de péptidos a partículas coloidales de oro dentro del rango específico. Usando la unidad de control de temperatura del espectrofotómetro visible UV, ajuste la solución a temperatura ambiente, aproximadamente 22 grados Celsius. Controle el pH inicial de la solución de muestra con un medidor de pH y ajústelo a un pH ligeramente inferior a siete.
Recoja el espectro de absorción dentro del rango de 400 a 800 nanómetros. A continuación, ajuste el pH de la muestra a aproximadamente un pH cuatro añadiendo incrementos de 1,0 microlitros de ácido clorhídrico 1,0 molar. Recoja el espectro de absorción en el mismo rango de 400 a 800 nanómetros.
A continuación, ajuste el pH de la muestra a aproximadamente un pH de 10 añadiendo incrementos de aproximadamente 1,5 microlitros de hidróxido de sodio 1,0 molar. Recoja el espectro de absorción dentro del mismo rango de longitud de onda de 400 a 800 nanómetros. Después de eso, cambie el pH entre pH cuatro y pH 10 10 veces agregando ácido clorhídrico o hidróxido de sodio.
Recoge continuamente el espectro de absorción a 25 grados centígrados. Obtenga el conjunto de datos ASCII de longitudes de onda en función de la absorbancia. Utilice el programa PeakFit para extraer las posiciones medias de los picos de las bandas.
Con la función plot, trace el conjunto de datos para visualizar la densidad óptica en función de la longitud de onda. Identifique y marque las longitudes de onda de pico iniciales, lambda uno y lambda dos, seleccionando sus posiciones aproximadas en los datos trazados. Ajuste los datos utilizando la función de ajuste de picos del programa de origen.
Obtenga el gráfico que muestra las posiciones de los picos centrales para cada lambda etiquetada como XCI, junto con las áreas de banda correspondientes, denotadas como AI. Exporte las posiciones de pico extraídas y las áreas correspondientes a un programa de hoja de cálculo para su análisis. Calcule el factor de ponderación, AI, para cada centro de pico comparando el área de la banda con el área total de todas las bandas utilizando la fórmula mostrada. A continuación, extraiga la posición media del pico utilizando la ecuación que se muestra en la pantalla.
Para generar un gráfico de reversibilidad, tabule las posiciones medias de los picos en función del número de operación N.Asigne el número de operación N como se menciona en la pantalla. Analice la posición del pico en N utilizando la fórmula mostrada. Transfiera el conjunto de datos calculado al software de origen y represúrelo.
Seleccione el ajuste de curva no lineal del análisis, introduzca los valores iniciales para A, B, C, D y E, y haga clic en ejecutar para completar el proceso de ajuste de curva. Para realizar la obtención de imágenes Raman, para cada muestra en el número de operación N, coloque 100 microlitros de solución en un disco de mica de un centímetro de diámetro. Deje que las muestras se sequen durante la noche antes de la medición.
A continuación, recoja imágenes de luz blanca para cada número de operación N. Prepare la muestra separada en un nuevo disco de mica, ya que el pH se altera continuamente entre cuatro y 10. Recoja la imagen Raman para cada número de operación, y utilizando las especificaciones mencionadas de un láser con una longitud de onda de 633 nanómetros. Capture imágenes en una cuadrícula de 100 por 100 píxeles con un tiempo de integración específico, centrándose en la región espectral deseada.
Trace el espectro representativo para cada número de operación N alineado en función de N.Construya una espectroscopia Raman tridimensional mejorada en superficie, o espectro SERS, en función de N para A beta 1-40-recubierto de oro de 20 nanómetros. Utilice la vista superior del espectro como un mapa de contorno para extraer los modos específicos asociados con una condición de pH particular. Identifique las características espectrales mejoradas exclusivamente solo con números de operación pares o impares.
La banda SPR de las nanopartículas de oro recubiertas de beta 1-40 A cambió de 530 nanómetros a unos 650 nanómetros cuando la solución se hizo más ácida. Esto correspondió a la formación de agregados coloidales de oro con monómeros A beta 1-40 desplegados según lo observado por TEM. El cambio de color dependiente del pH del oro recubierto de A beta 1-40 también fue evidente.
El desplazamiento reversible dependiente del pH de la banda media alcanzó su punto máximo entre una longitud de onda más corta y una longitud de onda más larga, y la morfología alterna dispersa y agregada observada en TEM confirmó la naturaleza cuasi-reversible del proceso. Las imágenes de luz blanca mostraron un patrón de agregación claro y reversible correspondiente a los cambios de pH, mientras que los espectros SERS mostraron cambios sutiles dependientes del pH en la región de las huellas dactilares.
