私の研究の焦点は、アミロイドベータ1-40が金ナノ粒子表面に吸収され、可逆的な凝集過程でアミロイドベータ1-40の重要な確認情報を取得することです。この研究分野では、逆凝集過程の熱的・化学的・動的情報を得ることが課題です。このプロジェクトの大きな発見は、アミロイドベータ1-40が金ナノ粒子表面に吸収されるときに、アミロイドベータ1-40の折り畳まれたまたは折り畳まれていない確認に寄与する特定の動きまたは振動モードを特定できることです。
SERS(表面増強ラマン散乱分光法)を使用する大きな利点は、非常に小さく弱い散乱信号を検出して、フォールディングとアンフォールディングを引き起こす重要なモードを特定できることです。同時に、凝集体の形態を特定することができます。このプロジェクトから得られる知見は、タンパク質間相互作用の重要な相互作用であり、これはオリゴマーを引き起こすために重要であり、これが線維形成につながるでしょう。
まず、マイクロピペットを使用して、1ミリグラムの凍結乾燥アミロイドベータ、またはAベータ1-40に1ミリリットルの蒸留脱イオン水を追加します。溶液をボルテックスミキサーで約30秒間混合します。室温(摂氏約20度)で溶液中に固体粒子が残っていないことを確認します。
次に、脱イオン水と蒸留水を使用してペプチドストック溶液を調製します。275ナノメートルでのチロシン吸収を分光学的に測定することにより、ペプチド濃度を決定します。Aベータ1-40ストック溶液を摂氏マイナス80度で保管します。
データ収集の約5分前にペプチドストック溶液を解凍します。15ミリリットルの遠心分離チューブで、8マイクロリットルのペプチド溶液と800マイクロリットルの金コロイド粒子を混合します。4.2ミリリットルの脱イオン蒸留水を加え、サンプルを10秒間ボルテックスします。
Aベータ1-40ペプチドの濃度を1.8ナノモルに固定し、ペプチドと金コロイド粒子の比率を特定範囲内に調整します。紫外可視分光光度計の温度制御ユニットを使用して、溶液を室温(摂氏約22度)にセットします。pHメーターを使用してサンプル溶液の初期pHをモニターし、pH 7をわずかに下回るように調整します。
400〜800ナノメートルの範囲で吸収スペクトルを収集します。次に、1.0モルの塩酸を1.0マイクロリットル刻みで加えることにより、サンプルのpHを約pH4に調整します。400〜800ナノメートルの同じ範囲にわたって吸収スペクトルを収集します。
次に、1.0モルの水酸化ナトリウムを約1.5マイクロリットル刻みで加えることにより、サンプルのpHを約pH10に調整します。400〜800ナノメートルの同じ波長範囲内の吸収スペクトルを収集します。その後、塩酸または水酸化ナトリウムのいずれかを追加して、pHをpH4からpH10の間で10回変更します。
摂氏25度で吸収スペクトルを連続的に収集します。波長のASCIIデータセットを吸光度の関数として取得します。PeakFitプログラムを使用して、バンドピークの平均位置を抽出します。
関数 plot を使用してデータセットをプロットし、光学密度を波長の関数として可視化します。プロットされたデータ内の近似位置を選択することにより、初期ピーク波長(ラムダ1とラムダ2)を特定してマークします。原点プログラムのピークフィット関数を使用してデータをフィットします。
XCI とラベル付けされた各ラムダの中央ピーク位置と、AI と表記された対応するバンド領域を表示するグラフを取得します。抽出したピーク位置と対応する領域をスプレッドシートプログラムにエクスポートして分析します。表示された式を使用して、バンドの面積をバンド全体の合計面積と比較することにより、各ピーク中心の重み付け係数 AI を計算します。次に、画面に表示される式を使用して平均ピーク位置を抽出します。
可逆性プロットを生成するには、画面に記載されているように、操作番号Nの関数として平均ピーク位置を表にします。表示された式を使用して、Nのピーク位置を分析します。計算したデータセットを元のソフトウェアに転送し、プロットします。
解析の非線形曲線フィッティングを選択し、A、B、C、D、Eの初期値を入力し、実行をクリックしてカーブフィットプロセスを完了します。ラマンイメージングを行うには、操作番号Nの各サンプルについて、直径1cmのマイカディスクに100マイクロリットルの溶液を置きます。測定する前に、サンプルを一晩乾燥させます。
次に、各操作番号N.pHが4から10の間で連続的に変化するため、新しいマイカディスク上に別々のサンプルを準備します。各操作番号のラマンイメージを収集し、前述の波長633ナノメートルのレーザーの仕様を使用します。100 x 100ピクセルのグリッドで、特定の積分時間で画像をキャプチャし、目的のスペクトル領域に焦点を当てます。
N.Construct a three-dimensional surface-enhanced Raman spectroscopy, or SERS spectrum, as a function of N for A beta 1-40-coated 20 nanometer gold.スペクトルの上面図を等高線マップとして利用し、特定のpH条件に関連する特定のモードを抽出します。偶数または奇数の操作番号でのみのみ強化されたスペクトル特徴を特定します。
Aベータ1-40被覆金ナノ粒子のSPRバンドは、溶液をより酸性にすると、530ナノメートルから約650ナノメートルにシフトしました。これは、TEMによって観察されたように、展開されたAベータ1-40モノマーを有する金コロイド凝集体の形成に対応していました。Aベータ1-40コーティングされた金のpH依存性の色の変化も明らかでした。
平均バンドの可逆的なpH依存性シフトは、短い波長とより長い波長の間でピークに達し、TEMで観察された分散形態と凝集体形態の交互は、プロセスの準可逆的な性質を確認しました。白色光イメージングでは、pHシフトに対応する明確で可逆的な凝集パターンが示されましたが、SERSスペクトルでは、フィンガープリント領域に微妙なpH依存性の変化が示されました。
