Nuestro programa de investigación se centra en comprender cómo se regulan las diferentes formas de muerte celular. Por lo general, estudiamos la muerte celular en el contexto de las terapias contra el cáncer con el objetivo de aprender cómo funcionan los medicamentos para activar la muerte celular y cómo hacer que estas respuestas sean mejores y más específicas. Cada vez está más claro que hay muchos tipos diferentes de muerte celular regulada.
En la actualidad, el campo ha identificado al menos 14 tipos de muerte mecánicamente distintos. La mayoría de estos causan una muerte morfológicamente necrótica y, en general, sabemos muy poco sobre cómo funcionan estas vías. Una forma eficaz de estudiar la regulación de la muerte celular es utilizar la genómica funcional.
En otras palabras, perturbar sistemáticamente cada gen y determinar cómo estas perturbaciones afectan a la muerte celular. Cuando se realiza en el contexto de medicamentos, esto se denomina perfil quimiogenético. Los exámenes de detección quimiogenética generalmente evalúan cómo los knockouts de genes afectan el tamaño final de la población.
Sin embargo, el tamaño de la población puede verse influenciado por cambios en la tasa de crecimiento, la tasa de mortalidad o ambas. Los métodos de cribado actuales no logran identificar los genes reguladores de la muerte debido a los efectos limitantes de la variación de la tasa de crecimiento. Medusa utiliza simulaciones de la respuesta a los fármacos para modelar cómo el cambio en la tasa de crecimiento o la tasa de mortalidad influye en el tamaño final de la población.
Estas simulaciones nos permiten extraer la tasa de mortalidad inducida por fármacos para cada gen en la pantalla y eliminar otros factores de confusión. Para empezar, las células de placa en placas negras de 96 pocillos de fondo claro a densidades de siembra entre 1500 y 5.000 células por pocillo. Incubar las placas a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono y humedad durante 16 a 24 horas. Preparar la dilución del fármaco en medios que contengan la concentración de citotox, optimizada previamente.
Limente una placa con Triton X a la concentración optimizada. A continuación, coloque la placa en el lector de placas y mida la fluorescencia del citotox en las placas experimentales en T0 utilizando los ajustes optimizados, y luego en un punto de tiempo posterior adecuado. Después del punto de tiempo final, lyice las placas experimentales utilizando Triton X para determinar el tamaño final de la población de cada condición.
Calcule la viabilidad fraccional utilizando los datos de los puntos finales y ajuste los resultados a las curvas de dosis-respuesta. Evaluar las curvas de dosis-respuesta para identificar dosis de fármacos que induzcan aproximadamente el 50% de la muerte celular. Después de optimizar la dosis del fármaco para inducir la muerte celular, asigne aleatoriamente ARN SG no objetivo a genes no objetivo.
Recorte los ARN SG con recuentos bajos en función de una estrategia de corte elegida. Simule todas las perturbaciones posibles en la tasa de crecimiento neto de la población o NPG mediante el uso de un bucle for para evaluar un rango de valores de NPG. Para cada ARN SG experimental, haga coincidir el cambio de pliegue simulado más cercano a los datos observados y asigne la tasa de crecimiento relativo correspondiente al ARN SG.
A continuación, determine la tasa de crecimiento inducida por el fármaco antes de la muerte a partir de los datos de recuento de células vivas. Ajusta los datos a una ecuación exponencial simple para derivar la tasa de crecimiento. Calcule la tasa de crecimiento inducida por el fármaco tras el inicio de la muerte combinando los datos de recuento de células vivas y los valores de grado del fármaco.
Represente el grado para la dosis de fármaco seleccionada en un gráfico de grado. Utilizando la coordinación determinada experimentalmente entre el crecimiento inducido por fármacos y la tasa de mortalidad, cree un modelo para simular el tamaño de la población inducida por fármacos a lo largo del tiempo. A continuación, desarrolle un modelo de Medusa que incluya NPG, las tasas de crecimiento inducidas por el fármaco antes y después del inicio de la muerte en duplicaciones por hora y la tasa de mortalidad inducida por el fármaco.
Establezca el punto de tiempo de inicio en cero horas y defina los puntos de tiempo finales para las afecciones tratadas y no tratadas. Simule todas las perturbaciones posibles en las tasas de crecimiento y mortalidad para el modelo de referencia. Para cada combinación, calcule el logaritmo en base dos del cambio de pliegue observado en el punto final del ensayo.
Para cada ARN SG, triangule la tasa de mortalidad inducida por el fármaco que produciría el cambio de pliegue observado. Comience por extraer la tasa de crecimiento relativo predeterminada. Determinar las tasas de crecimiento inducido por fármacos antes y después del inicio de la muerte.
Aplique la tasa de crecimiento relativo del NPG para calcular las tasas de crecimiento proporcionales para las tasas de crecimiento inducidas por medicamentos antes y después del inicio de la muerte. Utilizando las restricciones para NPG, la tasa de crecimiento inducida por fármacos antes y después del inicio de la muerte, identifique el cambio de pliegue simulado más cercano al cambio de pliegue observado para cada ARN SG. Determine el crecimiento a nivel genético y las tasas de mortalidad para cada gen en la biblioteca.
Calcule las tasas medias de crecimiento y mortalidad de todos los ARN SG asociados con cada gen, que suelen oscilar entre 4 y 10 ARN SG. Para calcular los valores empíricos de P, arranque los datos del nivel de ARN SG y aplique una corrección de la tasa de descubrimiento falso utilizando el procedimiento de Benjamin Hochberg. La viabilidad fraccional de las células U2 OS disminuyó en función de la dosis, observándose aproximadamente un 50% de letalidad a los cinco micromolares de etopósido después de 96 horas.
El tamaño de la población recuperada disminuyó entre un 40% y un 50% después de cuatro días de exposición a cinco etopósidos micromolares, lo que confirma la muerte celular durante el tratamiento farmacológico. El análisis de ley proyectó que el etopósido de cinco micromolares causó una reducción significativa en la tasa de crecimiento y que la muerte celular se inició solo después de la detención completa del crecimiento. El análisis de Medusa reveló que las cinco células knockout de XRCC mostraron un crecimiento lento en condiciones no tratadas y altas tasas de mortalidad inducida por fármacos bajo el tratamiento con etopósido.
Los experimentos de validación confirmaron que las células knockout de XRCC 5 mostraron un crecimiento más lento en condiciones no tratadas y tasas de mortalidad elevadas bajo etopósido, alineándose con las predicciones de Medusa.
